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兔源支气管败血波氏杆菌PRN蛋白的表达及其免疫保护性研究

作　者: 胡佳佳
导　师: 恽时锋
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 兔 支气管败血波氏杆菌 百日咳杆菌粘附素 原核表达 间接ELISA 免疫保护
分类号: S855.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb是引起动物呼吸道疾病的一种重要病原菌,可广泛感染家畜、野生动物和实验动物呼吸道上皮,能引起猪、马、猫、狗、兔、小鼠、豚鼠等哺乳动物的呼吸道疾病,常导致感染动物发生鼻炎和支气管肺炎。人也有感染该菌的报道,尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。该菌在兔群中感染率非常高,危害家兔健康,危害兔产业的健康发展。百日咳杆菌粘附素(pertactin, PRN)是Bb的主要保护性抗原,存在于菌体外膜上。PRN还是Bb定植过程中的重要黏附因子,是Bb定植过程的关键。研究表明,PRN能够显著降低Bb在免疫小鼠肺脏的定植水平。因此本试验将prn基因进行了克隆,表达,并对其免疫保护特性进行了研究；同时本试验还利用重组蛋白PRN作为包被抗原建立了检测支气管败血波氏杆菌血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验结果如下1.参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)的prn基因序列(AY376325)设计了一对特异性扩增相应核苷酸片段的上、下游引物。将PCR扩增产物克隆入pMD19-Tvector,经酶切鉴定、测序正确后,将目的片段连接至原核表达载体pGEX-4T-1载体中,构建原核表达载体为pGEX-4T-1-prn。将此表达载体质粒转化E.coli BL21(DE3),表达并纯化重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下主要以包涵体的形式高效表达,同时有少量以可溶形式存在于上清中；Western blot显示重组蛋白能被兔Bb特异性阳性血清识别,证明重组蛋白具有良好的反应原性,有望成为实用有效的诊断抗原和疫苗抗原。2.本试验应用表达的重组蛋白PRN为包被抗原,建立了一种检测支气管败血波氏杆菌血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的最佳包被浓度为500ng/mL,最佳封闭条件为2%的BSA37℃封闭1.5h,最适检测血清稀释度为1：40,血清最适作用时间为60min,酶标二抗最适稀释度为1:5000,最适作用时间为60min,底物最适显色时间为37℃,10min。试验证实该方法不仅敏感、特异、快速、简便,而且经济、易于重复,具有良好的应用前景。3.取支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)断尾采血,用建立的间接ELISA测定其血清效价。用2×LD50Bb对免疫后小鼠进行腹腔注射攻毒,观察十天并记录小鼠死亡情况。结果显示浓度较高的两个重组蛋白PRN免疫组和灭活疫苗免疫组小鼠均没有死亡,存活率为100%。浓度最低的重组蛋白PRN免疫组小鼠死亡2只,存活率为66.7%。阴性对照组小鼠死亡5只,存活率仅为16.6%,空白对照组小鼠均死亡。死亡的小鼠死前均表现为食欲减退,精神不振,从其肝脏、肺脏均能够分离到形态典型的Bb菌。本研究成功表达了百日咳杆菌粘附素；重组蛋白PRN对ICR小鼠具有良好的免疫保护性；本研究还成功应用重组蛋白PRN建立了一种检测支气管败血波氏杆菌血清抗体的间接ELISA诊断方法。从而为该病的诊断和防制,以及疫苗的开发奠定了重要基础。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10缩略词表  10-11第一部分 文献综述  11-33  1 支气管败血波氏杆菌病及其危害  11-12  2 支气管败血波氏杆菌病原学  12-17    2.1 形态及培养特性  12-13    2.2 抗原结构及生物学活性  13-17  3 流行病学和致病机理  17-18  4 症状及病变  18-19    4.1 临床症状  18    4.2 大体解剖观察  18-19    4.3 组织病理学观察  19  5 诊断  19-22    5.1 细菌学诊断  19    5.2 血清学诊断  19-21    5.3 分子生物学诊断  21-22  6 药物敏感性  22  7 防治  22-24    7.1 免疫接种  22-23    7.2 药物预防  23    7.3 综合防制  23-24  参考文献  24-33第二部分 试验部分  33-67  第一章 兔源支气管败血波氏杆菌PRN基因的克隆、表达与鉴定  33-47    1 材料与方法  34-40      1.1 材料  34      1.2 方法  34-40    2 结果  40-43      2.1 prn基因的扩增  40-41      2.2 克隆质粒pMD19-T-prn的鉴定  41-42      2.3 重组表达质粒pGEX-4T-1-prn的鉴定  42      2.4 pGEX-4T-1-prn重组蛋白的表达  42-43      2.5 重组蛋白表达形式的鉴定  43      2.6 Western blot结果  43    3 讨论  43-45    参考文献  45-47  第二章 兔源支气管败血波氏杆菌ELISA检测方法的建立  47-59    1 材料与方法  48-50      1.1 材料  48      1.2 试验方法及内容  48-50    2 结果  50-54      2.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定  50      2.2 封闭液和封闭时间的确定  50-51      2.3 抗原抗体最佳作用时间的确定  51-52      2.4 羊抗兔IgG的最佳稀释度和作用时间  52-53      2.5 底物作用时间  53      2.6 结果判定  53      2.7 阻断实验  53      2.8 敏感性试验  53      2.9 间接ELISA保存期试验  53      2.10 间接ELISA重复性试验  53-54      2.11 临床应用  54    3 讨论  54-56    参考文献  56-59  第三章 重组蛋白PRN对小鼠的免疫保护性  59-67    1 材料与方法  60-61      1.1 材料  60      1.2 方法  60-61    2 结果  61-63      2.1 免疫小鼠血清中IgG抗体效价测定  61-62      2.2 腹腔内攻毒试验结果  62-63    3 讨论  63-65    参考文献  65-67全文总结  67-69附录  69-73致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病 > 杆菌病
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