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过敏原TBb抗原表位区及其关键氨基酸的鉴定

作　者: 李平
导　师: 王转花
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苦荞麦 表位区 过敏原TBb 关键氨基酸 免疫学活性分析
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


荞麦是一种药食同源的作物,具有较高的营养、药用及保健价值。荞麦中富含矿物质、膳食纤维、蛋白质、维生素和多酚类化合物等生物活性物质,能防治糖尿病、高血压和冠心病等多种疾病。但是,越来越多的研究表明,荞麦中具有的一些成分可使人们在接触或食用它后产生多种过敏症状,如哮喘、皮炎等,严重的还可以引起休克甚至死亡。而引起这些过敏反应的只是荞麦蛋白质中的部分抗原决定簇,也就是指蛋白质中能刺激机体产生抗体的数个至数十个氨基酸,其又被称作“表位”(epitope)。荞麦过敏原蛋白分子和其过敏机制的研究对于荞麦过敏症的精确诊断和安全治疗至关重要且刻不容缓。本课题组先前的研究已经获得一种编码苦荞全长过敏原的cDNA序列,并且命名为TBt,于2006年在GenBank上登录(登录号为DQ849083)。根据生物信息学的分析结果,苦荞全长过敏原TBt包含两个结构域,即C端结构域(TBa)和N端结构域(TBb)。进一步分析表明,分子量约35kD的TBb是苦荞麦中引起过敏的主要过敏原之一,然而,其导致过敏的表位以及主要表位中的关键氨基酸尚待确定。本文根据表位预测结果,利用分段表达的方法,将过敏原TBb的11个表位分成4组,设计相应的引物,通过克隆分别获得了这4个表位区段的基因,并构建其原核表达载体,转入大肠杆菌中进行诱导表达。根据氨基酸序列比对及同源建模的分析结果,采用定点突变技术构建了表位区段F2的3个突变体R139A、R141A和D144A。利用Ni2+-NTA亲和层析法对表达产物进行纯化,免疫学技术对其进行免疫活性鉴定。实验结果表明：上述表达纯化的重组蛋白,经SDS-PAGE分析显示其蛋白纯度均大于95%。ELISA和点杂交的结果表明,表位区段F2与过敏病人血清IgE具有最强的结合活性,它可能是TBb的主要表位区段。氨基酸序列比对及同源建模的分析说明,F2中的表位6(IFRVREGDV)含有一些已经识别或者具有结构同源性的氨基酸。对F2及其突变体进行的免疫活性实验发现,与野生型的F2相比,R141A具有比R139A和D144A更弱的IgE结合活性。经序列比对及同源建模,确定表位区段F2可能包含TBb的线性IgE结合区域。通过定点突变及免疫学活性鉴定,证明苦荞过敏原TBb的第141位的精氨酸是它的关键氨基酸,第139位的精氨酸和144位的天冬氨酸可能对TBb的过敏性也起到了一定作用。这是关于TBb主要表位区段及其关键氨基酸的第一次报道,这些发现对TBb低过敏性食物的生产和苦荞麦过敏特异性的免疫治疗等研究具有非常重要的意义。

全文目录


摘要  10-12ABSTRACT  12-14第一章 文献综述  14-26  1.1 过敏原表位概述  14-21    1.1.1 过敏原表位的定义  14    1.1.2 植物过敏原及表位的分类  14-15    1.1.3 过敏原表位的研究进展  15-19    1.1.4 交叉过敏反应  19-21  1.2 同源建模概述  21-23    1.2.1 同源建模的定义  21    1.2.2 同源建模法的步骤  21-23  1.3 荞麦过敏原表位的研究进展  23-25    1.3.1 甜荞过敏原Fage 1、Fag 13S和BWp16  23-24    1.3.2 苦荞过敏原TBa  24-25  1.4 本研究的目的和意义  25-26第二章 TBb抗原表位区的表达纯化及免疫学活性分析  26-36  2.1 材料  26-27    2.1.1 菌种及质粒  26    2.1.2 主要的工具酶及试剂  26-27    2.1.3 寡聚核苷酸引物  27  2.2 方法  27-31    2.2.1 各表位区段重组质粒的构建  27-28    2.2.2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  28-29    2.2.3 表达产物的Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化  29    2.2.4 蛋白浓度测定  29-30    2.2.5 免疫学活性分析  30-31  2.3 结果  31-35    2.3.1 各表位区段重组质粒的构建  31-32    2.3.2 表位区段蛋白的表达及纯化  32-33    2.3.3 蛋白浓度测定  33    2.3.4 免疫学活性分析  33-35  2.4 讨论  35-36第三章 过敏原TBt的同源性比对及N-端结构域的定点突变  36-44  3.1 材料  36-37    3.1.1 菌种及质粒  36    3.1.2 主要的工具酶及试剂  36-37    3.1.3 寡聚核苷酸引物  37  3.2 方法  37-38    3.2.1 全长过敏原TBt序列的同源性比对  37    3.2.2 TBt的同源建模  37-38    3.2.3 N-端结构域(TBb)表位区段F2的定点突变  38  3.3 结果  38-42    3.3.1 TBt序列的同源性比对  38-39    3.3.2 TBt的同源建模  39-41    3.3.3 N-端结构域(TBb)表位区段F2的定点突变  41-42  3.4 讨论  42-44第四章 TBb突变体的表达、纯化及免疫学活性分析  44-50  4.1 材料  44-45    4.1.1 菌种及质粒  44    4.1.2 主要的工具酶及试剂  44-45  4.2 方法  45    4.2.1 突变体重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  45    4.2.2 表达产物的Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化  45    4.2.3 蛋白浓度测定  45    4.2.4 免疫学活性分析  45  4.3 结果  45-48    4.3.1 重组突变体蛋白的表达及纯化  45-47    4.3.2 蛋白浓度测定  47    4.3.3 免疫学活性分析  47-48  4.4 讨论  48-50参考文献  50-56攻读学位期间取得的研究成果  56-57致谢  57-58个人简况及联系方式  58-60

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学 > 化学分析与鉴定
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