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苦荞中芦丁降解酶的分离纯化及产酶菌株的筛选

作　者: 罗庆林
导　师: 邵继荣
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苦荞麦 芦丁 芦丁降解酶 槲皮素 青霉 菌株
分类号: S517
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


苦荞（Fagopyrum tatarican Gaerth）是唯一一种不属于禾本科的双子叶杂粮作物,其籽粒中不仅含有丰富的芦丁,而且还有少量的芦丁降解酶（rutin degradingenzymes,RDEs）。在一定条件下,芦丁可以降解成槲皮素、芸香糖等物质,由于槲皮素具有抗氧化、清除体内自由基、防癌抗癌等生理功能,其具有广阔的应用开发前景。目前,芦丁转化成槲皮素的方法主要是酸水解,但大量酸的使用容易造成环境污染,新兴的微生物发酵技术由于成本低廉、环境污染小等特点逐渐走上时代的舞台。本论文首先探讨了芦丁降解酶的提取、分离和纯化,以及酶学性质和反应的最适条件;然后从自然发霉的苦荞粉中筛选出一株产芦丁降解酶的高活性菌株,并对菌株进行形态和分子生物学鉴定;最后研究了活性菌株接种于苦荞粉发酵,以期提高槲皮素的得率,从而为微生物发酵辅助提取槲皮素探索出一条有效途径。本研究具体结果如下:1.从成熟的苦荞籽粒中提取出了芦丁降解酶粗酶液,证实了苦荞籽粒中芦丁降解酶得存在。并用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-100和阴离子交换柱DEAE cellulose-32分离纯化,在出峰时收集、浓缩各峰相对应的洗脱液,然后分别检测酶活性。用聚酰胺薄层层析（polyamide-TLC）定性检测槲皮素的生成,根据槲皮素的斑点确定有各峰的活性,之后用HPLC测定活性峰的酶活。结果酶的比活性由粗酶液59.2U/mg提高到671.4U/mg,纯化倍数达到了11.3倍,回收率为3.5%。2.经过柱分离纯化后所得的酶液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测,酶分子量大小为60kDa左右。3.紫外分光光度法对芦丁降解酶反应条件进行研究,结果最适温度为40℃,当温度高于60℃时酶才开始缓慢失活;最适pH值为5.0,酶活随pH变化而变化。4.从自然发霉的苦荞粉中驯化、分离菌株,用polyamide-TLC检测出3株菌株有产芦丁降解酶活性,分别编号为W2、Y2和B3。3株菌株经HPLC测定,表明B3菌株活性相对较高,单位活性达到3.42U/mL,总活性为171.0U。5.选取相对活性较高的B3菌株,从形态和分子生物学方面进行鉴定。其形态特征为:菌落呈青色,质地粉粒状。菌丝有横隔,分身孢子梗顶端不膨大,无顶囊,经多次分枝产生几轮对称或不对称的小梗,小梗顶端有成串的分身孢子。由分身孢子梗、小梗、分身孢子等组成了分身孢子穗,分身孢子穗呈扫帚状。确定为青霉属Penicillium。进一步对B3菌株进行18s rDNA-ITS序列同源性进行分析,表明B3菌株与青霉菌Penicillium farinosum（基因库中编号:AF527057.1）在系统进化树上的位置最接近,同源性达到100%,B3菌株为Penicillium farinosum。6.B3菌液接种于苦荞粉中（料液比=1:2.5）30℃培养5d,80%乙醇提取,直接与苦荞粉相同条件发酵并在相同条件下提取,比较得出添加B3菌株的苦荞粉培养基中槲皮素得率提高了5.1倍。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-11
1 文献综述  11-20
  1.1 前言  11
  1.2 苦荞中类黄酮的药用价值  11-13
    1.2.1 苦荞麦中类黄酮物质概述  11-12
    1.2.2 类黄酮的药用价值  12-13
  1.3 芦丁、槲皮素提取和测定方法研究  13-14
    1.3.1 芦丁、槲皮素提取方法研究  13
    1.3.2 芦丁、槲皮素检测方法研究  13-14
  1.4 芦丁降解酶及其酶活研究  14-16
    1.4.1 芦丁降解酶提取、纯化研究进展  14-15
    1.4.2 芦丁降解酶酶活测定方法  15-16
  1.5 产酶菌株筛选与鉴定的研究  16-18
    1.5.1 产酶菌株的筛选  16-17
    1.5.2 真菌的提取及ITS鉴定  17-18
  1.6 研究目的、意义  18
    1.6.1 研究目的  18
    1.6.2 研究意义  18
  1.7 研究内容  18-20
2 材料与方法  20-30
  2.1 材料、药品与仪器  20
    2.1.1 实验材料  20
    2.1.2 主要药品  20
    2.1.3 主要仪器  20
  2.2 实验设计与方法  20-30
    2.2.1 苦荞中芦丁降解酶的提取  20-21
    2.2.2 苦荞中芦丁降解酶的纯化  21
    2.2.3 芦丁降解酶酶活测定  21-22
    2.2.4 酶反应条件的研究  22-23
    2.2.5 蛋白质相对分子量的测定(SDS-PAGE)  23-25
    2.2.6 蛋白质含量测定  25
    2.2.7 产酶菌株的筛选  25-28
    2.2.8 菌株的鉴定  28
    2.2.9 菌株的保存  28
    2.2.10 微生物发酵辅助提取槲皮素  28-30
3 实验结果与分析  30-43
  3.1 芦丁、槲皮素标准曲线绘制  30-32
    3.1.1 紫外分光光度法检测槲皮素  30
    3.1.2 芦丁、槲皮素标准聚酰胺薄层层析  30-31
    3.1.3 芦丁、槲皮素标准HPLC图谱  31-32
  3.2 芦丁降解酶提取、纯化及酶活测定  32-38
    3.2.1 芦丁降解酶的提取及纯化  32-34
    3.2.2 SDS-PAGE测定分子量  34-35
    3.2.3 蛋白质含量测定  35-36
    3.2.4 芦丁降解酶活性测定  36
    3.2.3 芦丁降解酶反应条件的研究  36-38
  3.3 产芦丁降解酶菌株的筛选及活力测定  38-43
    3.3.1 聚酰胺薄层层析筛选菌株  38-39
    3.3.2 HPLC测定菌株活性  39-40
    3.3.3 菌株形态、分子生物学鉴定  40-42
    3.3.4 B_3菌株发酵辅助提取槲皮素  42-43
4 讨论与结论  43-47
  4.1 讨论  43-46
    4.1.1 芦丁降解酶及菌株活性检测方法  43-44
    4.1.2 芦丁降解酶及其应用  44
    4.1.3 苦荞微生物发酵  44-45
    4.1.4 实验创新点  45
    4.1.5 研究前景  45-46
  4.2 结论  46-47
    4.2.1 芦丁降解酶的分离、纯化及酶活测定～  46
    4.2.2 产酶菌株的筛选  46
    4.2.3 B_3菌株对苦荞籽粒中槲皮素得率影响  46-47
参考文献  47-52
致谢  52

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 荞麦
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