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菠萝叶纤维脱胶毕赤酵母工程菌的构建、表达以及应用

作　者: 高秋芳
导　师: 郭安平
学　校: 海南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 木聚糖酶 果胶裂解酶 毕赤酵母 菠萝叶纤维 脱胶
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 22次
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内容摘要


菠萝叶纤维作为新型纺织材料,对它脱胶的研究已经引起人们的关注。果胶裂解酶具有降解果胶的作用,木聚糖酶具有降解半纤维素的主要组成部分木聚糖的作用,因此,果胶裂解酶和木聚糖酶在脱胶的过程中起关键性的作用。本室已在大肠杆菌系统中成功表达了果胶裂解酶PelC,并且保留了表达载体pPIC9K-PelC和果胶裂解酶毕赤酵母工程菌P2。本文在此基础上,从绿色木霉(AS3.3711)中克隆了果胶裂解酶基因xyn2,并将xyn2克隆到酵母穿梭型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K-xyn2。将pPIC9K-xyn2线性化,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。对P2、X5、PX6诱导表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表明：木聚糖酶毕赤酵母工程菌X5分泌表达木聚糖酶,分子量为21KD；果胶裂解酶毕赤酵母工程菌P2分泌表达果胶裂解酶,分子量为43 KD；果胶裂解酶和木聚糖酶双价工程菌PX6分泌表达果胶裂解酶和木聚糖酶,分子量分别为43KD和21KD。对P2、X5、PX6诱导表达产物进行酶的活力测定以及性质分析,发现果胶裂解酶毕赤酵母工程菌P2分泌表达果胶裂解酶,活力最高为14.2 U／ml；木聚糖酶毕赤酵母工程菌X5分泌表达木聚糖酶,活力最高为5.8U／ml；果胶裂解酶和木聚糖酶双价工程菌PX6分泌果胶裂解酶活力最高为12.6 U／ml,木聚糖酶活力最高为4.2 U／ml。果胶裂解酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为5.4；木聚糖酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为6.0。将双价工程菌PX6发酵生产出高活性的果胶裂解酶和木聚糖酶。用正交的方法确定了菠萝叶纤维脱胶的优化工艺参数为：时间4h,粗酶液用量为12%,pH值为5.5,温度为50℃。脱胶后的结果表明：纤维素的含量得到了提高,特别是对果胶质的降解达到了菠萝叶纤维纺织工艺的要求,但是半纤维素含量偏高。纤维细度得到了提高,同时纤维细度也变小,但是脱胶后断裂强度有所降低。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-11
1 绪论  11-30
  1.1 课题背景  11
  1.2 菠萝叶纤维资源与利用现状  11-13
    1.2.1 菠萝叶纤维的总体概况  11-12
    1.2.2 菠萝叶纤维的性能  12
    1.2.3 菠萝叶纤维的应用前景  12-13
  1.3 果胶酶的研究进展  13-19
    1.3.1 果胶酶的定义  13
    1.3.2 果胶酶的类型及作用机理  13-17
    1.3.3 果胶酶的来源  17-18
    1.3.4 果胶酶在纺织上的应用  18-19
  1.4 木聚糖酶的研究进展  19-22
    1.4.1 木聚糖酶的定义及分类  19-20
    1.4.2 木聚糖酶的作用机理与酶学性质  20-21
    1.4.3 木聚糖酶在纺织工业中的应用  21-22
  1.5 毕赤酵母表达系统研究进展  22-29
    1.5.1 毕赤酵母表达载体  23-24
    1.5.2 毕赤酵母表达菌株  24-25
    1.5.3 外源基因的整合  25
    1.5.4 高拷贝转化菌株的筛选  25-26
    1.5.5 影响外源基因表达的因素  26-29
      1.5.5.1 外源基因的自身特点  26-27
      1.5.5.2 外源基因的剂量  27-28
      1.5.5.3 发酵系统培养  28
      1.5.5.4 产物稳定性  28-29
  1.6 本课题研究的主要内容目的和意义  29-30
    1.6.1 主要内容  29
      1.6.1.1 木聚糖酶基因的获得与克隆载体的构建  29
      1.6.1.2 重组表达载体的构建  29
      1.6.1.3 毕赤酵母工程菌的构建  29
      1.6.1.4 摇瓶表达鉴定三种毕赤酵母工程菌表达蛋白情况以及酶活性质分析  29
      1.6.1.5 果胶裂解酶和木聚糖酶双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用  29
    1.6.2 目的  29
    1.6.3 意义  29-30
2 试验材料与方法  30-46
  2.1 材料与试剂  30-32
    2.1.1 菌种和质粒  30
    2.1.2 生化试剂(盒)  30
    2.1.3 主要仪器  30
    2.1.4 主要培养基和常用溶液  30-32
      2.1.4.1 绿色木霉培养基  31
      2.1.4.2 LB(Luria-Bertani)培养基  31
      2.1.4.3 酵母培养基母液的配制  31
      2.1.4.4 酵母培养基  31-32
      2.1.4.5 DNA电泳缓冲液(g/L)  32
      2.1.4.6 TE缓冲液(pH 8.0)  32
      2.1.4.7 SDS-PAGE配胶贮存液  32
      2.1.4.8 DNS的配制  32
  2.2 方法与步骤  32-46
    2.2.1 木聚糖酶基因xyn2的克隆  32-39
      2.2.1.1 绿色木霉的预处理  32-33
      2.2.1.2 引物设计与合成  33
      2.2.1.3 绿色木霉总RNA的提取  33-34
      2.2.1.4 xyn2基因的反转录  34-35
      2.2.1.5 xyn2基因的PCR反应  35
      2.2.1.6 RT-PCR产物的回收  35-36
      2.2.1.7 xyn2基因与pMD19-T simple Vector的连接  36
      2.2.1.8 大肠杆菌DH5a感受态的制备  36
      2.2.1.9 连接产物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞  36-37
      2.2.1.10 快速菌液PCR初步鉴定  37
      2.2.1.11 重组质粒的提取  37-38
      2.2.1.12 重组质粒的酶切鉴定  38
      2.2.1.13 xyn2基因的测序及序列分析  38-39
    2.2.2 pPIC9K-xyn2表达载体的构建与鉴定  39
    2.2.3 含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的构建  39-42
      2.2.3.1 pPIC9K-xyn2表达载体的线性化  39
      2.2.3.2 毕赤酵母宿主菌感受态细胞的制备  39
      2.2.3.3 线性化表达载体的电击转化  39-40
      2.2.3.4 多拷贝插入重组菌的筛选  40
      2.2.3.5 多拷贝插入重组菌的鉴定  40-41
      2.2.3.6 含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的分泌表达  41-42
        2.2.3.6.1 摇瓶表达  41
        2.2.3.6.2 表达产物的SDS-PAGE检测  41-42
    2.2.4 含pelC基因毕赤酵母工程菌构建  42
      2.2.4.1 含pelC基因毕赤酵母工程菌分泌表达  42
    2.2.5 含xyn2基因和pelC基因双价工程菌的构建  42-43
      2.2.5.1 pPIC9K-xyr2表达载体和pPIC9K-pelC表达载体的线性化  42
      2.2.5.2 毕赤酵母宿主菌感受态细胞的制备  42
      2.2.5.3 线性化表达载体的电击转化  42-43
      2.2.5.4 多拷贝插入双价工程菌的筛选  43
      2.2.5.5 多拷贝插入双价工程菌的鉴定  43
      2.2.5.6 双价工程菌的分泌表达  43
    2.2.6 三种工程菌的重组表达酶的活力测定  43-44
      2.2.6.1 待测酶液的制备  43
      2.2.6.2 木聚糖酶酶活力测定  43
      2.2.6.3 果胶裂解酶活力测定  43-44
    2.2.7 三种工程菌的重组表达酶的性质分析  44
    2.2.8 双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用  44-46
      2.2.8.1 发酵粗酶液的制备  44
      2.2.8.2 脱胶试验步骤  44
      2.2.8.3 单因子试验  44
      2.2.8.4 脱胶多因子试验  44-45
      2.2.8.5 脱胶效果判定  45
      2.2.8.6 多因子正交试验结果的验证  45-46
3 结果与分析  46-57
  3.1 xyn2基因的克隆  46-48
    3.1.1 绿色木霉总RNA提取  46
    3.1.2 xyn2基因片度的分离  46-47
    3.1.3 xyn2基因序列的测定  47-48
  3.2 pPIC9K-xyn2表达载体的构建与鉴定  48-49
  3.3 含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的构建  49-51
    3.3.1 pPIC9K-xyn2重组表达载体的线性化  49-50
    3.3.2 线性化pPIC9K-xyn2重组表达载体的电击转化  50
    3.3.3 多拷贝插入木聚糖酶基因毕赤酵母工程菌的筛选  50
    3.3.4 多拷贝插入木聚糖酶基因毕赤酵母工程菌的PCR鉴定  50
    3.3.5 表达产物的SDS-PAGE的检测  50-51
  3.4 含peIC基因毕赤酵母工程菌构建  51-52
    3.4.1 含pelC基因毕赤酵母工程菌分泌表达产物的SDS-PAGE的检测  51-52
  3.5 双价工程菌的构建  52-54
    3.5.1 pPIC9K-xyn2和pPIC9K-pelC重组表达载体的线性化  52
    3.5.2 线性化pPIC9K-xyn2和pPIC9K-pelC重组表达载体的电击转化  52
    3.5.3 多拷贝插入双价工程菌的筛选  52
    3.5.4 多拷贝插入双价工程菌的PCR鉴定  52-53
    3.5.5 双价工程菌分泌表达产物的SDS-PAGE的检测  53-54
  3.6 重组表达酶的活力测定  54-55
  3.7 P2产果胶裂解酶、X5产木聚糖酶、PX6产果胶裂解酶、木聚糖酶性质分析  55
  3.8 双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用  55-57
    3.8.1 单因子试验分析  55
    3.8.2 多因子试验分析  55-57
      3.8.2.1 正交试验结果  55-56
      3.8.2.2 多因子正交试验结果验证分析  56-57
4 讨论  57-59
  4.1 绿色木霉RNA的提取  57
  4.2 表达载体的线性化  57
  4.3 电击转化与整合  57-58
  4.4 表达产物的检测  58-59
5 结论  59-60
  5.1 木聚糖酶基因的获得  59
  5.2 毕赤酵母重组菌的构建  59
  5.3 毕赤酵母重组菌的分泌表达  59
  5.3 毕赤酵母重组菌分泌酶的活力和性质分析  59
  5.4 双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用  59-60
参考文献  60-68
附录  68-71
  附录1. 符号宿略表  68-69
  附录2. pPIC9K表达载体图谱  69-70
  附录3. 菠萝叶纤维脱胶前后对照图  70-71
致谢  71

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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