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Depp蛋白与Sedlin蛋白的相互作用及SEDL基因突变致迟发性骨骺发育不良机制的初步研究

作　者: 陈应炉
导　师: 范礼斌
学　校: 安徽医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Depp Sedlin 酵母双杂交系统 免疫共沉淀 蛋白-蛋白相互作用 定点突变
分类号: R682
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的运用酵母双杂交技术研究Depp蛋白与Sedlin蛋白的相互作用区域；构建Depp蛋白及Depp蛋白N端C端缺失突变体和Sedlin蛋白的真核表达载体,共同转染至COS7细胞,分别观察在哺乳动物细胞中的共定位情况；构建Sedlin蛋白四个点突变体D47Y,S73L,F83S,V130D到pcDGFP真核载体中转染到COS7细胞中观察单转定位情况与野生型的差别,分别再与带Flag标签的Depp蛋白共同转染至COS7细胞观察共定位情况。构建带GFP标签的Depp蛋白与带Flag标签的Sedlin蛋白共同转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内Depp蛋白与Sedlin蛋白能否相互作用。方法以pACT2-Depp为模板,PCR扩增Depp蛋白N端300bp和C端339bp的DNA片段,分别将片段插入到pGADT7载体中,构建Depp缺失突变体pGADT7-Depp-N300和pGADT7-Depp-C339。将两种缺失突变体分别与pGBKT7-SEDL共同转化酵母菌AH109感受态细胞,SD培养基(-Trp/-Leu/-His/+3-AT)/X-α-gal上生长筛选蓝色,呈蓝色的克隆是X-α-gal活性为阳性克隆；以pGBKT7-SEDL为模板,用定点突变的方法分别扩增出BD-SEDL-D47Y,S73L,F83S,V130D。分别与pGADT7-Depp共同转化酵母菌AH109感受态细胞,筛选蓝色克隆。以pGBKT7-SEDL为模板,PCR扩增Sedlin蛋白全长编码序列,目的片段经BamHI和EcoRI酶切后回收,回收片段插入到带GFP标签的载体中,构建表达载体pcDGFP-SEDL及四个点突变体,后转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞的定位与野生型的差别,再分别与带Flag标签的Depp蛋白共同转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察共定位情况；PCR扩增Sedlin编码序列,扩增产物插入到带Flag标签的pCDNA3.1载体中,构建真核表达载体pCDNA-FLAG-SEDL。通过酶切和测序鉴定后,将质粒pCDGFP-Depp和pCDNA-FLAG-SEDL共同转染COS7细胞,通过免疫荧光的方法观察Depp蛋白和Sedlin蛋白在细胞内的共定位情况；共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,进行免疫共沉淀,后通过Western blot检测在哺乳动物细胞内Depp蛋白与Sedlin蛋白能否结合。结果经酶切和测序鉴定,各重组质粒均构建正确。通过营养筛选及α-半乳糖苷酶活性的测定标明Depp蛋白的N端和C端都能和Sedlin蛋白相互作用,Sedlin蛋白点突变体只有D47Y呈阳性,其他三个点突变是阴性；免疫荧光显微镜观察实验观察到Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中共同集中分布于细胞核周区域,且N端共定位和野生型相似；Sedlin蛋白的四个点突变体和Flag-Depp蛋白共同转染至COS7细胞中,表明GFP-SEDL-D47Y共定位和野生型分别相似,在核周核内都有分布,而S73L,F83S,V130D主要共定位于核周。Western blot检测显示Depp蛋白和N端均表达,而C端未见表达；免疫共沉淀和Western blot检测证明Depp蛋白和Sedlin蛋白能在HEK293T细胞中相互结合。结论Depp蛋白与Sedlin蛋白相互作用关键区域位于其N端300bp编码100个氨基酸的片段内；免疫荧光实验说明Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中集中共定位于细胞核周围区域,提示Depp蛋白和Sedlin蛋白在细胞内的相互作用。Sedlin蛋白点突变体单转定位和双转定位表明,D47Y在细胞定位和野生型相似,而S73L,F83S,V130D定位主要分布在核周；免疫共沉淀实验表明Depp蛋白和Sedlin蛋白在哺乳动物细胞质能相互结合；

全文目录


英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
引言  12-14
材料与方法  14-39
结果  39-49
讨论  49-53
结论  53-54
对课题的进一步设想  54-55
参考文献  55-60
附录  60-62
致谢  62-63
综述  63-72
  参考文献  70-72

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 骨科学（运动系疾病、矫形外科学） > 骨的畸形
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