学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鸡Mx基因的克隆及其抗AIV活性的研究

作　者: 肖志广
导　师: 孟庆文
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: Mx基因基因克隆定点突变禽流感病毒
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 43次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

Mx蛋白是干扰素诱导的动力蛋白样GTP酶，在生物界广泛存在，具有广谱的抗病毒作用。编码Mx蛋白的基因最初是在野生型A2G小鼠中发现的，因能保护A2G小鼠耐受相对其它随机交配小鼠更高粘液病毒剂量的能力而命名为Mx（myxovirus-resistant）基因。2002年Ko等比较氨基酸多态性与Mx蛋白抗病毒活性的关系时发现，当鸡Mx蛋白第631号氨基酸位点为天冬酰胺时，该蛋白具有抗流感病毒和水疱性口炎病毒活性，当第631号氨基酸位点被丝氨酸取代时则无抗病毒活性，然而，Benfield等研究人员于2008年通过体外实验数据指出，鸡Mx蛋白第631号氨基酸位点为天冬氨酸时并不能保护鸡抵抗H1N1型流感病毒感染。因此，本实验旨在研究鸡Mx蛋白在该位点为不同氨基酸时是否会特异性地影响鸡的抗流感病毒能力，从而为提高鸡自身抗病毒能力及应对禽类病毒的威胁提供新思路。本研究首先从我国7个主要地方品种鸡的脾脏中提取总RNA作模板，通过RT-PCR法扩增出长2118bp的Mx基因全长编码区序列，共编码705个氨基酸。PCR产物测序结果表明Mx基因具有多态性，通过比对发现不同品种鸡Mx基因有17个碱基差异，12个发生错义突变，导致了氨基酸位点的改变。对Mx基因第1892号核苷酸（对应氨基酸第631位）进行单核苷酸多态性分析发现7个地方品种鸡中共出现2种等位基因A和G，3种基因型AA、GG和AG。随后筛选出第631号氨基酸位点分别为天冬酰胺和丝氨酸的两个纯合子鸡的Mx基因，扩增产物由pMD18-T载体亚克隆至pcDNA3.1（+）真核表达载体，构建重组鸡Mx基因的真核表达质粒pcDNA3.1-Mx，酶切鉴定正确后对Mx基因第1892号核苷酸位点进行定点突变，使两纯合子鸡Mx基因编码的氨基酸第631位实现天冬酰胺与丝氨酸间的替换。重组表达质粒经菌液PCR、酶切鉴定及测序验证正确后，提取并纯化重组质粒。经脂质体介导转染MDCK细胞，RT-PCR、Western blotting和流式细胞技术（FCM）从RNA、蛋白和细胞水平证明Mx基因的表达。结果显示：对鸡Mx基因进行定点突变修饰成功，且已成功构建能正确表达鸡Mx蛋白的真核重组质粒。用H5N1亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96感染转染后细胞，于感染后不同时间点用Real Time PCR、间接免疫荧光（IFA）和流式细胞技术（FCM）检测Mx蛋白对AIV增殖的影响，结果显示：两个纯合子鸡突变前与突变后的Mx基因在重组质粒转染细胞中均能抑制AIV增殖，但各质粒间差异不显著，在细胞水平上未发现鸡Mx蛋白第631位氨基酸多态性对AIV的抗性差异。

鸡Mx基因的克隆及其抗AIV活性的研究

内容摘要

全文目录

相似论文