学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

rBTI活性位点分析及其突变体的研究

作　者: 田欣
导　师: 王转花
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 荞麦蛋白酶抑制剂定点突变活性位点抗肿瘤
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 17次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

蛋白酶抑制剂(PI, protease inhibitor)在动物、植物、微生物以及人类自身的代谢调控过程中起着非常重要的作用。抑制剂与蛋白酶的协同调节使体内各种生理过程得以有条不紊的进行。由于抑制剂功能的重要性与独特性,越来越多的科研工作者开始将目光转移到抑制剂的研究上。迄今为止,已经有数百种蛋白酶抑制剂相继得到分离和鉴定,并且有多种抑制剂被证明具有治疗肿瘤、人类获得性免疫缺陷症等恶性疾病的潜在应用价值。植物是各种蛋白酶抑制剂的主要来源。在植物中,丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究最早,认识也最为深入。根据抑制剂之间的序列同源性、活性位点位置以及二硫键数目,人们将植物来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂分为Bowman-Birk, Kunitz, Potato I, Potato II, Cucurbit, Cereal, Taumatin-like和Ragi A1等家族。目前的研究主要集中于Bowman-Birk家族、Kunitz家族和Potato I家族。荞麦属于药食同源作物,是我国传统的小杂粮作物。作为一种健康食品,荞麦越来越受到人们的青睐。有研究证明,来自荞麦中的蛋白酶抑制剂具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。我们先前的研究通过分子生物学技术获得了一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(Recombinant buckwheat trypsin inhibitor, rBTI),其生物学活性与天然BTI活性相近,研究表明,rBTI属于丝氨酸蛋白酶抑制剂中的Potato I家族。体外实验显示,rBTI能诱导不同肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无副作用。rBTI作为一种功能性蛋白,对其结构与功能的深入研究具有重要的理论意义及实际价值。为了揭示rBTI结构与功能的关系,表征rBTI的结构特点,本研究依据序列比对和胰蛋白酶酶解实验结果,利用定点突变方法将rBTI氨基酸序列中第45位Arg进行突变,先后构建了R45A-aBTI和R45F-fBTI两个突变体。抑制活性实验显示,突变体aBTI和fBTI均丧失了对胰蛋白酶的抑制活性,从而确定了rBTI的活性位点为Arg45。对突变体的抑制活性鉴定我们发现,aBTI和fBTI虽然失去了对胰蛋白酶的抑制作用,却分别显示出对弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。理化性质分析表明,野生型抑制剂rBTI和两个突变型抑制剂具有较好的热稳定性和酸碱稳定性。MTT比色法以及细胞核形态学观察结果显示,突变体aBTI和fBTI在体外仍然能有效抑制HL-60和EC9706肿瘤细胞的增殖,并且具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。本研究采用定点突变技术和理化性质分析,不仅确定了rBTI的活性位点,而且获得了两种新型蛋白酶抑制剂aBTI和fBTI。体外功能鉴定表明,rBTI活性位点的改变并不影响其对肿瘤细胞的生长抑制作用。这为进一步研究蛋白酶抑制剂结构与功能的关系以及抗肿瘤药物的研制提供了新的思路。

全文目录

中文摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第一章文献综述  14-25
  1.1 引言  14
  1.2 蛋白酶抑制剂概述  14-19
    1.2.1 蛋白酶抑制剂的结构特点  14-16
    1.2.2 蛋白酶抑制剂的生物学功能  16-19
  1.3 植物来源的蛋白酶抑制剂研究进展  19-20
    1.3.1 植物蛋白酶抑制剂的研究进展  19
    1.3.2 荞麦蛋白酶抑制剂的研究现状  19-20
  1.4 论文设计思路  20-21
    1.4.1 研究背景及意义  20
    1.4.2 研究目的  20-21
  参考文献  21-25
第二章 rBTI活性位点的确定  25-36
  2.1 引言  25
  2.2 实验材料  25-26
    2.2.1 菌株和质粒  25
    2.2.2 主要酶及生化试剂  25
    2.2.3 实验仪器  25-26
  2.3 实验方法  26-30
    2.3.1 rBTI序列分析  26
    2.3.2 定点突变的依据  26-28
    2.3.3 表达质粒pQE-31-aBTI和pQE-31-fBTI的构建  28-29
    2.3.4 aBTI和fBTI基因在大肠杆菌中的分泌表达、纯化与鉴定  29
    2.3.5 突变体aBTI和fBTI对胰蛋白酶的抑制活性分析  29
    2.3.6 二硫键对rBTI活性中心的影响  29-30
  2.4 实验结果  30-33
    2.4.1 表达质粒pQE-31-aBTI和pQE-31-fBTI的构建  30-31
    2.4.2 突变体的表达与纯化  31-32
    2.4.3 突变体胰蛋白酶抑制活性鉴定  32-33
    2.4.4 二硫键对rBTI抑制活性的影响  33
  2.5 讨论  33-35
  参考文献  35-36
第三章野生型和突变型BTI的性质比较  36-44
  3.1 引言  36-37
  3.2 实验材料  37
  3.3 实验方法  37-38
    3.3.1 抑制活性鉴定  37
    3.3.2 抑制剂动力学分析  37
    3.3.3 抑制剂稳定性研究  37-38
    3.3.4 圆二色光谱分析  38
  3.4 实验结果  38-42
    3.4.1 突变体抑制活性鉴定  38-40
    3.4.2 抑制剂的稳定性对比分析  40-41
    3.4.3 圆二色光谱对比分析  41-42
  3.5 讨论  42-43
  参考文献  43-44
第四章突变型荞麦蛋白酶抑制剂抑制肿瘤细胞增殖的初步鉴定  44-52
  4.1 引言  44
  4.2 实验材料  44-45
    4.2.1 细胞株及主要试剂  44-45
    4.2.2 实验仪器  45
  4.3 实验方法  45-46
    4.3.1 细胞培养  45
    4.3.2 抑制剂对HL-60细胞和EC9706细胞增殖的MTT检测  45
    4.3.3 细胞核形态学观察  45-46
    4.3.4 统计学处理  46
  4.4 实验结果  46-50
    4.4.1 野生型和突变型抑制剂对肿瘤细胞生长的影响  46-49
    4.4.2 细胞核形态学观察  49-50
  4.5 讨论  50-51
  参考文献  51-52
总结与展望  52-53
攻读学位期间取得的研究成果  53-54
致谢  54-55
个人简况及联系方式  55-57

rBTI活性位点分析及其突变体的研究

内容摘要

全文目录

相似论文