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绒山羊CRISPs的cDNA克隆、CRISP2的表达定位及其与PDIA3相互结合的研究

作　者: 黄文强
导　师: 邢万金
学　校: 内蒙古大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 绒山羊 Pdia3 CRISPs 酵母双杂交 免疫共沉淀
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
引　用: 1次
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内容摘要


哺乳动物授精是一个多步骤的复杂过程,包括很多独特的行为,有很多特异性蛋白或脂质等分子的参与。其中蛋白二硫键异构酶(PDI)家族成员Pdia3 (ERp57)和CRISP (cysteine-rich secretory proteins,CRISPs)家族蛋白参与了精卵融合,但是对于其介导精卵融合的分子机制尚不清楚。本实验克隆了绒山羊CRISPs家族各成员蛋白的cDNA序列,制备了小鼠抗羊CRISP2多克隆抗体,用免疫组织化学和免疫细胞化学技术研究了CRISP2蛋白在睾丸中的的表达定位,并用免疫共沉淀和酵母双杂交技术检测了绒山羊CRISP2和Pdia3在细胞内能否直接相互结合,以图解析CRISP2和Pdia3在精卵融合中的分子机制。实验首先设计保守性引物,采用RT-PCR方法成功克隆了绒山羊的CRISP1、CRISP2、CRISP3 cDNA(同时也克隆到了绵羊的CRISP2、CRISP3 cDNA)。克隆到的绒山羊CRISPs蛋白长度均在240 aa左右,均有20 aa左右长度的信号肽。将所得到的绒山羊和绵羊CRISPs氨基酸序列同GenBank和Ensembl数据库中公布的其它物种的CRISPs氨基酸序列进行比对,发现不同物种的CRISPs蛋白同源性较高,且有16个高度保守的半胱氨酸残基,成为该家族的特征。将克隆得到的绒山羊的CRISP1、CRISP2、CRISP3 cDNA去信号肽序列后,分别构建了pGEX-CRISP1、pGEX-CRISP2、pET44a-CRISP3原核表达载体,诱导表达出融合蛋白GST-CRISP1、GST-CRISP2、Nus-CRISP3。用纯化的GST-CRISP2融合蛋白作为免疫原免疫昆明(KM)小鼠,最后腹腔注射S180细胞,制备了小鼠抗绒山羊CRISP2的腹水多克隆抗体,并采用戊二醛交联法纯化了自制的腹水多抗体。Western blotting分析显示所制抗体能特异性识别组织中的CRISP2蛋白。免疫组织化学检测绒山羊睾丸组织发现CRISP2蛋白大量出现于睾丸曲精细管内侧中央区,即成熟精子出现的区域。免疫细胞化学检测精子细胞显示CRISP2蛋白位于精子头部的赤道区至顶体部位。本实验还构建了pcDNA-CRISP2和pcDNA-Pdia3真核表达载体,共转染Hela细胞,进行了免疫共沉淀实验分析。同时也构建了酵母双杂交载体pGAD-CRISP2与pGBK-Pdia3,进行了酵母双杂交实验。两实验结果均发现CRISP2与Pdia3在细胞内能够相互结合。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-11
第一部分 研究论文  11-78
  第一章 绵羊和绒山羊CRISPs家族成员cDNA的克隆  11-30
    前言  11-12
    一、材料和方法  12-17
      1.1 材料  12-13
      1.2 方法  13-17
    二、结果  17-29
      2.1 绒山羊睾丸、附睾组织总RNA的提取  17
      2.2 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定  17-18
      2.3 重组克隆T载体的构建鉴定  18
      2.4 绒山羊和绵羊CRISPs cDNA全长测序结果分析  18-22
      2.5 以绒山羊CRISP2为代表进行氨基酸序列的分析  22-23
      2.6 绒山羊CRISP2二级结构和性质以及三维结构图  23-25
      2.7 不同动物的CRISP蛋白氨基酸序列的比较分析  25-29
    三、讨论  29-30
  第二章 绒山羊CRISPs家族的融合蛋白的原核表达及GST-CRISP2蛋白的分离纯化  30-43
    前言  30-31
    一、材料和方法  31-37
      1.1 材料  31-32
      1.2 实验方法  32-37
    二、结果  37-42
      2.1 pGEX-GC1、pGEX-GC2、pET44a-GC3重组载体的酶切及测序鉴定  37
      2.2 pGEX-GC1、pGEX-GC2、pET44a-GC3在大肠杆菌中的诱导表达  37-39
      2.3 GST-CRISP1、GST-CRISP1、Nus-CRISP3融合蛋白的Western blot鉴定  39-40
      2.4 GST-CRISP2融合蛋白的可溶性及包涵体分析  40-41
      2.5 GST-CRISP2融合蛋白的纯化与浓度测定  41-42
    三、讨论  42-43
  第三章 山羊CRISP2腹水多克隆抗体的制备及纯化  43-53
    前言  43-44
    一、材料和方法  44-48
      1.1 材料  44
      1.2 实验方法  44-48
    二、结果  48-52
      2.1 小鼠抗绒山羊CRISP2多克隆抗体的鉴定与特异性分析  48-50
      2.2 小鼠抗山羊CRISP2多克隆抗体的效价测定  50
      2.3 小鼠抗绒山羊CRISP2多克隆抗体的纯化  50-52
    三、讨论  52-53
  第四章 CRISP2在山羊睾丸组织和精子中的定位检测  53-60
    前言  53-54
    一、材料与方法  54-57
      1.1 实验材料  54-55
      1.2 实验方法  55-57
    二、结果  57-59
      2.1 绒山羊睾丸和附睾组织中CRISP2的定位  57-58
      2.2 绒山羊精子中CRISP2的定位  58-59
    三、讨论  59-60
  第五章 绒山羊CRISP2与PDIA3相互作用的研究  60-78
    前言  60-62
    一、材料与方法  62-70
      1.1 材料  62-64
      1.2 实验方法  64-70
    二、结果  70-75
      2.1 真核表达载体的构建  70-71
      2.2 免疫共沉淀及Western blot结果  71-73
      2.3 酵母双杂交结果  73-75
    三、讨论  75-78
第二部分 文献综述  78-87
  1. CRISP蛋白的结构和功能特点  78-82
  2. CRISP蛋白家族各成员  82-86
    2.1 附睾的CRISP1蛋白  82-84
    2.2 睾丸的CRISP2蛋白  84-85
    2.3 组织多样性的CRISP3蛋白  85
    2.4 附睾的CRISP4蛋白  85-86
  3. 展望  86-87
参考文献  87-91
致谢  91-92
读硕士期间参与的科研项目和发表的学术论文  92
  1. 参加的研究项目  92
  2. 发表的学术论文  92

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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