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禽流感野鸭源分离株H2N2亚型和H3N8亚型基因特征及遗传进化分析

作　者: 王建琪
导　师: 华育平
学　校: 东北林业大学
专　业: 生理学
关键词: 禽流感病毒绿头鸭 H2N2 H3N8 基因重组遗传进化分析基因特征
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 64次
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内容摘要

禽流感(Avian Influenza, AI)是一种从呼吸系统到全身性败血症的传染性疾病,是由A型流感病毒引起。其感染禽类后,会造成很高的死亡率,使养禽业受到很大的经济损失。野鸟中广泛分布着禽流感病毒,研究表明禽流感病毒的天然储库是野生水禽,其迁徙的习性对病毒的传播起重要作用。东北林业大学野生动物疾病教研室分别在2006年和2007年从经由三江自然保护区迁徙的绿头鸭体内分离出两株低致病性禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/137/2006(H2N2)和A/mallard/SanJiang/359/2007(H3N8),测定了以上两个毒株的全基因组,并对其生物学特性进行了分析。本研究采用无特定病原体(SPF)鸡胚增殖禽流感病毒野鸭源分离株A/Mallard/SanJiang/137/2006(H2N2)和A/mallard/SanJiang/359/2007(H3N8),从鸡胚尿囊液中提取病毒基因组,再参考Genbank中已知的基因序列合成以上两个毒株8个片段的特异性全序列引物,并通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术将其全部序列片段扩增,其中PB1、PB2两段基因均分为两段扩增。将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。序列测定正确后,与国内外H2N2和H3N8亚型的部分分离株的相应基因及其推导的氨基酸序列进行同源性比较和遗传进化分析,并绘制了H2及H3亚型AIV全景进化树。结果表明：所得到的两株AIV的8个节段均含有完整的开放阅读框架以及5’端和3’端的非编码区序列。通过对分离株A/Mallard/SanJiang/137/2006(H2N2)和A/mallard/SanJiang/359/2007(H3N8)与世界各地H2N2和H3N8代表株的核苷酸和氨基酸同源性以及遗传演化结果的分析,证实分离株A/Mallard/SanJiang/137/2006(H2N2)和A/mallard/SanJiang/359/2007(H3N8)起源于欧亚系,本研究中的AIV分离株均有基因重组的现象发生,可以推测与迁徙过程中携带各种不同亚型AIV的野鸟密切接触及各种不同亚型AIV的频繁感染有关。从野禽中分离出H2N2和H3N8亚型禽流感病毒在我国尚无报道或报道很少,因此本研究的H2N2和H3N8亚型禽流感病毒全基因序列分析结果对于禽流感的深入研究,特别是对野生水禽禽流感病毒的携带状况和分子流行病学的研究具有重要的参考价值。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-18
  1.1 课题背景  10
  1.2 禽流感病毒的概况  10-13
    1.2.1 禽流感病毒的病原学概况  10-11
    1.2.2 禽流感病毒的分类  11
    1.2.3 禽流感宿主范围及变化  11-12
    1.2.4 禽流感与人类健康  12-13
    1.2.5 禽流感的治疗  13
  1.3 禽流感病毒的生物学特性  13-16
    1.3.1 血凝素(Hemmagglutinin,HA)  13-14
    1.3.2 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)  14
    1.3.3 聚合酶复合体基因  14-15
    1.3.4 核蛋白(NueleoProtein,NP)  15
    1.3.5 基质蛋白(Mateix Protein,M)  15
    1.3.6 非结构蛋白(Nonstructural Protein,NS)  15-16
  1.4 流感病毒H2N2和H3N8亚型的概况  16
    1.4.1 流感病毒H2N2的概况  16
    1.4.2 流感病毒H3N8的概况  16
  1.5 本课题研究的目的和意义  16-18
2 材料和方法  18-24
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 病毒  18
    2.1.2 SPF鸡胚及鸡红细胞  18
    2.1.3 实验试剂  18
    2.1.4 实验仪器  18-19
    2.1.5 特异性引物  19
  2.2 实验方法  19-24
    2.2.1 病毒的分离  19
    2.2.2 红细胞凝集试验(HA)  19-20
    2.2.3 病毒RNA的提取  20
    2.2.4 cDNA的合成  20
    2.2.5 全基因组PCR扩增  20-21
    2.2.6 PCR产物的克隆  21-23
    2.2.7 PCR方法鉴定重组质粒  23
    2.2.8 序列测定  23
    2.2.9 序列分析和遗传进化分析  23-24
3 实验结果  24-59
  3.1 RT-PCR检测结果  24-25
  3.2 全基因组测序结果  25-34
  3.3 核苷酸序列同源性比较  34-40
  3.4 编码氨基酸序列分析比较  40-42
    3.4.1 裂解位点分析  40
    3.4.2 潜在糖基化位点分析  40
    3.4.3 AIV分离株基因特征  40-42
  3.5 遗传进化关系分析  42-59
4 讨论  59-63
  4.1 MSJ359(H3N8)和MSJ137(H2N2)病毒株的序列分析  59-60
  4.2 分离株同源性及遗传进化分析  60-62
  4.3 本章小结  62-63
5 结论  63-64
参考文献  64-71
附录  71-72
攻读学位期间发表的学术论文  72-73
致谢  73-74

禽流感野鸭源分离株H2N2亚型和H3N8亚型基因特征及遗传进化分析

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