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野猪源PRRSV Shaanxi-2株分离鉴定、全基因测序及遗传进化分析

作　者: 张冲
导　师: 杨增岐
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV 野猪 分离鉴定 全基因测序 遗传进化分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种以妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征的病毒性传染病。其病原PRRSV属于套式病毒目、动脉炎病毒科成员,基因组全长约为15 kb,含有9个开放阅读框（open reading frame,ORF）。自1996年报道分离到PRRSV以来,PRRSV就在我国广泛肆虐,特别是2006年夏秋季节我国南方部分省市相继暴发“猪高热病”疫情,该病传播迅速,在短短的半年内几乎传遍了大半个中国,造成大批猪只的死亡,给中国的养猪行业造成了巨大的经济损失。经诊断发现,该病的主要致病病原是高致病性蓝耳病病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRSV）。2006年初冬陕西省连续出现了大批猪的死亡,发病症状及流行病学特征与“猪高热病”报道相似。本实验是在进行陕西“猪高热病”流行病学调查时从西安野生动物园的发病野猪所采集病料中分离得到PRRSV,对其进行全基因测序并与国内外其他流行毒株进行比对分析,研究其遗传变异情况及分子生物学特征,研究的主要内容如下:1.将采集到的肺脏、淋巴结等病料进行研磨滤过处理,接种到生长成单层且状态良好的Marc-145细胞,第二代后细胞出现明显的CPE,经抗体中和试验、RT-PCR、间接免疫荧光染色（IFA）等方法鉴定分离到的病毒为PRRSV,将其命名为PRRSV Shaanxi-2。2.根据VR-2332和HB-1（sh）/2002序列分段设计引物,采用Marc-145细胞增殖的第5代病毒提取RNA,应用RT-PCR方法扩增野猪源PRRSV Shanxi-2各段基因,将其连入pMD18-T载体,连接产物转化DH5α感受态细胞。经菌液PCR及质粒酶切鉴定,筛选出含阳性重组质粒的菌液,送北京奥科公司测序。根据各片段之间相重叠的区域,用DNAStar将测序成功的各序列依次拼接获得完整的全基因,然后将其与GenBank中发表的典型毒株的基因序列进行比对分析,构建系统进化树,分析Shaanxi-2的遗传变异及分子生物学特征。结果表明:Shaanxi-2与欧洲型毒株的差异较大,与LV4.2.1的核苷酸同源性仅为60.7%。与BJ-4、CH-la、CH-1R等2006年以前国内分离的美洲型毒株相比存在一定的差异,核苷酸同源性在89.2%94.9%之间,与2006年以后国内分离的HP-PRRSV毒株相比较为保守,核苷酸同源性保持在98.8%以上。非结构蛋白基因以Nsp2区段发生的变异最大,推导氨基酸的同源性与BJ-4相比仅为76.5%,与JXA1相比为98.3%。结构蛋白基因与2006年前分离的毒株相比ORF3、ORF5变异最大,ORF6、ORF7较为保守,但与HP-PRRSV相比,ORF7相对变异最大,ORF3ORF6都显得较为保守。Shaanxi-2符合HP-PRRSV的分子特征:5’UTR第120位出现碱基“A”的缺失,3’UTR第19位出现碱基“G”的缺失,Nsp2区段第481位出现一个“L”氨基酸的缺失及533561位出现连续29个氨基酸的缺失。与PRRSV毒力相关的9个氨基酸比对发现在这些位点上Shaanxi-2与HP-PRRSV的保持高度一致,且与疫苗株、传统弱毒株有明显的差异,但Shaanxi-2在Nsp2 G191、ORF2 S23、ORF3 A225、ORF4 G43、ORF5 R164、ORF7 R48S49这些位点上的氨基酸不同于HP-PRRSV而与疫苗株及传统弱毒株保持相同。野猪源PRRSV Shaanxi-2株与国内流行的其他毒株相比基因序列未发现显著差异,说明陕西与其地区流行的毒株起源相同,且初步推断野猪作为宿主不会使病毒发生明显的变异。综合Nsp2,ORF5及全基因的遗传进化分析,证明PRRSV Shaanxi-2属于HP-PRRSV遗传进化中的一个分支,但出现了部分变异使其具备了新的特点。本实验室进行的动物回归实验也证实Shaanxi-2与HP-PRRSV生物学特性存有差异,它并不表现高致病性,可以导致猪只发病但并不能将其致死。本研究对陕西省分离的野猪源性PRRSV毒株Shaanxi-2进行了测序及比对分析,使我们对陕西省PRRSV的来源、遗传背景及进化方向有了初步的了解,为陕西PRRS的免疫防治提供了极有价值的参考资料。同时该研究丰富了PRRSV基因库资源,为后续深入研究PRRSV基因功能,揭示PRRSV致病的分子机制,研制PRRSV基因疫苗,最终为有效的防控PRRS打下良好的基础。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
文献综述  13-26
  第一章 猪繁殖与呼吸综合征及其病原的研究进展  13-26
    1.1 PRRS 概述  13-16
      1.1.1 PRRS 的历史  13-14
      1.1.2 PRRS 的临床症状  14-15
      1.1.3 PRRS 的诊断研究  15-16
    1.2 PRRSV 病原学研究  16-20
      1.2.1 PRRSV 的分类地位及类型  16-17
      1.2.2 PRRSV 形态特征及基本特性  17
      1.2.3 PRRSV 起源的推测  17-18
      1.2.4 PRRSV 的分离培养  18
      1.2.5 PRRSV 的致病机理  18-19
      1.2.6 PRRSV 的流行病学研究  19-20
    1.3 PRRSV 的分子生物学研究  20-26
      1.3.1 PRRSV 的基因组结构  20-21
      1.3.2 PRRSV 的分子遗传变异  21-26
试验研究  26-54
  第二章 野猪源PRRSV SHAANXI-2 株的分离与鉴定  26-36
    2.1 试验材料  26-29
      2.1.1 试验病料  26
      2.1.2 细胞、单抗及高免血清  26
      2.1.3 主要试剂  26-27
      2.1.4 主要试验仪器  27
      2.1.5 试验相关试剂的配制  27-29
      2.1.6 引物设计  29
    2.2 试验方法  29-32
      2.2.1 病料的采集及处理  29
      2.2.2 病毒RNA 的提取  29
      2.2.3 RNA 的反转录  29-30
      2.2.4 病毒DNA 的提取  30
      2.2.5 PCR 反应  30
      2.2.6 细胞的复苏与培养  30-31
      2.2.7 病毒分离培养  31
      2.2.8 病毒中和试验  31
      2.2.9 间接免疫荧光检测  31
      2.2.10 TCID_(50) 测定  31-32
    2.3 结果  32-34
      2.3.1 病料RT-PCR 检测结果  32
      2.3.2 病毒分离结果  32-33
      2.3.3 血清中和试验结果  33
      2.3.4 RT-PCR 鉴定病毒增殖结果  33
      2.3.5 间接免疫荧光检测结果  33
      2.3.6 TCID_(50) 测定结果  33-34
    2.4 讨论  34-35
    2.5 小结  35-36
  第三章 野猪源PRRSV SHAANXI-2 株全基因序列测定  36-46
    3.1 试验材料  36-38
      3.1.1 毒株、细胞及菌种  36
      3.1.2 主要试剂  36-37
      3.1.3 主要仪器  37
      3.1.4 试验相关试剂的配制  37-38
      3.1.5 引物设计  38
      3.1.6 生物学软件  38
    3.2 试验方法  38-43
      3.2.1 病毒的增殖  38
      3.2.2 病毒RNA 的提取及反转录  38
      3.2.3 全基因扩增  38-39
      3.2.4 PCR 产物的胶回收  39-40
      3.2.5 胶回收产物与pMD-18T Vector 连接  40-41
      3.2.6 感受态细胞的制备（CaC12 法）  41
      3.2.7 连接产物的转化  41-42
      3.2.8 菌液PCR 鉴定  42
      3.2.9 重组质粒的提取  42
      3.2.10 重组质粒酶切鉴定  42-43
      3.2.11 阳性菌液的保存与送测  43
      3.2.12 全基因序列拼接  43
    3.3 试验结果  43-44
      3.3.1 全基因各片段PCR 扩增结果  43-44
      3.3.2 全基因序列拼接结果  44
    3.4 讨论  44-45
    3.5 小结  45-46
  第四章 野猪源PRRSV SHAANXI-2 基因组分子遗传特征分析  46-54
    4.1 材料  46
      4.1.1 PRRSV 核苷酸序列  46
      4.1.2 分子生物学分析软件  46
    4.2 方法  46-47
      4.2.1 序列比对分析  46
      4.2.2 系统进化分析  46
      4.2.3 毒力相关氨基酸的比对分析  46-47
    4.3 结果  47-52
      4.3.1 序列比对分析结果  47-51
      4.3.2 全基因的系统进化分析  51-52
    4.4 讨论  52-53
    4.5 小结  53-54
结论  54-55
参考文献  55-63
英文缩略词及中英文对照  63-65
致谢  65-66
作者简介  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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