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猪链球菌毒力指示蛋白基因多态性研究

作　者: 朱伟峰
导　师: 金梅林
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌毒力相关因子基因多态性选择压力基因重组水平转移生态位
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪链球菌是一种世界范围内危害养猪业的细菌性病原。同时猪链球菌也是一种重要的人兽共患传染病病原。在世界上许多国家里血清2型都是优势血清型。经常被用作毒力指示蛋白的毒力相关因子有三个：溶菌酶释放蛋白(MRP),胞外蛋白因子(EF)和溶血素(SLY)。尽管在以前的研究已经使我们对猪链球菌有了更深入的认识,但是这些研究并没有使我们找到防控猪链球菌的有效策略。于是我们准备通过全新角度的研究,即研究MRP、EF和SLY的基因多态性,进而通过这些具体事例的研究来考察猪链球菌泛基因组的特征、猪链球菌生态学上的特征,进化生物学上的特征,最终考察猪链球菌的研究和防控策略。首先是在猪链球菌2型菌株中研究毒力指示蛋白的基因多态性。我们先对180株猪链球菌2型菌株的MRP、EF、SLY相应染色体区域测序然后描述了基因型和致病性之间的联系同时也检测了宿主对于这三个毒力指示蛋白的基因所承受的选择压力。发现一些菌株中mrp和epf在形式上表现为丢失。在这些菌株中这些蛋白共有3个主要的基因型,尽管MRP的基因型有多种,但是SLY&EF的基因型可以被认为是只有两种：sly+epf+(有时是sly+epf*)和sly0epf0。这些基因型同样与毒力和分离株的系统发育关系相呼应。经过检测这三个毒力相关因子的基因上都不存在显著的正选择压力。与传统的PCR方法相比对毒力指示蛋白基因位点进行测序使我们获取了更多关于猪链球菌的信息,特别是关于猪链球菌基因多态性的信息和猪链球菌与宿主相互作用的信息。接下来我们进一步在50株不同血清型猪链球菌菌株中研究了毒力指示蛋白的基因多态性。我们发现MRP基因相应染色体序列可以被分为12类,EF基因相应染色体序列可以被分为7类。对于基因分布和结构的分析显示这些基因变种是猪链球菌整合外源基因的结果。我们同样发现了插入序列和polyG等与猪链球菌基因交换相关的遗迹。猪链球菌不同基因型在猪链球菌系统发育树上的分布与系统发育树的分支相呼应,进而猪链球菌种群可以分成4个群。在另外90株临床分离株中的研究结果又证实这些群与菌株的来源有显著的相关性。这就提示我们mrp和epf的不同变种是与猪链球菌的不同生态位相联系的。综合考虑,我们的数据提示可以得出这样的结论,异质性是猪链球菌基因组的重要特征,基因变种的存在是导致我们在一些菌株中不能检测到mrp和epf的重要原因。这些基因变种是在猪链球菌整合外源基因的结果,其整合机制可能是多样的。猪链球菌获取基因变种并不是随意的,而是受到猪链球菌生态位影响的。通过这两个具体的研究我们可以发现猪链球菌泛基因组具有细菌泛基因组的一般特征,同时发现同一个基因也可以有不同变种,这些变种主要是猪链球菌整合外源基因的结果,其机制可能是多样的,这增加了防控猪链球菌感染的难度。但是我们的研究又表明这些基因变种的分布是与猪链球菌的系统发育关系密切联系的,又与猪链球菌的生态位密切联系,于是我们建议以后将猪链球菌种群划分为全身感染型、肺炎型和偏利共生型三个生态型分别研究,这样会减少猪链球菌基因组异质性对于研究的干扰。我们的数据还提示猪链球菌的致病性可能是由多种因子共同介导,依据细菌泛基因组的一般特征——决定适应性的关键基因位于附属基因组中的特化基因组中,我们建议首先确定猪链球菌特化基因组中所包含的基因,然后依据这些基因找到以这些基因为关键点的基因互作网络,最后依据这些互作网络制定出消除猪链球菌危害的最终策略。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
1 猪链球菌研究综述  11-15
  1.1 猪链球菌研究进展  11-12
    1.1.1 流行病学  11
    1.1.2 微生物学  11
    1.1.3 毒力因子分子生物学  11-12
  1.2 其他领域相关研究进展  12-15
    1.2.1 泛基因组学  12-13
    1.2.2 生态学  13-14
    1.2.3 进化生物学  14-15
2 猪链球菌2型菌株中毒力指示蛋白的基因多态性  15-29
  2.1 材料方法  15-18
    2.1.1 试验所用临床分离株  15
    2.1.2 扩大培养与提取基因组  15-16
    2.1.3 克隆并描述这些菌株中的MRP、EF和SLY相应染色体区域  16-17
    2.1.4 描述MRP、EF、SLY基因型与分离株致病性的联系  17
    2.1.5 检测不同基因型与菌株系统发育的联系  17
    2.1.6 检测各毒力相关因子基因上的选择压力  17-18
    2.1.7 基因序列的注册号  18
  2.2 结果  18-26
    2.2.1 描述MRP、EF、SLY相应染色体区域序列所具有的特征  18-21
    2.2.2 mrp的亚型  21-22
    2.2.3 基因型及菌株的致病性  22-23
    2.2.4 分离株的系统发育关系  23-25
    2.2.5 作用于mrp,epf和sly上的选择压力  25-26
  2.3 讨论  26-27
  2.4 小结  27-29
3 猪链球菌不同血清型菌株中毒力指示蛋白的基因多态性  29-53
  3.1 材料与方法  29-32
    3.1.1 菌株与基因组制备  29-30
    3.1.2 对MRP和EF相应染色体区域克隆测序  30
    3.1.3 MRP或EF的不同基因型在猪链球菌不同菌株中的分布  30
    3.1.4 分析序列  30-31
    3.1.5 构建猪链球菌的系统发育树  31
    3.1.6 描述其他6个毒力相关基因在系统发育树上的分布  31
    3.1.7 在90株临床菌株中检测基因型与分离来源的联系  31-32
  3.2 结果  32-48
    3.2.1 MRP和EF基因座位相应染色体区域的基因组成  32-39
    3.2.2 构建猪链球菌的系统发育树  39-43
    3.2.3 有关整合外源基因的线索  43
    3.2.4 其他6个毒力相关基因在猪链球菌系统发育树上的分布  43
    3.2.5 不同猪链球菌种群的的特征  43-47
    3.2.6 在临床菌株中检测基因型与菌株来源的联系  47-48
  3.3 讨论  48-51
  3.4 小结  51-53
4 总结  53-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
附录  63-84
攻读硕士学位期间发表论文情况  84

猪链球菌毒力指示蛋白基因多态性研究

内容摘要

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