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野鸟源H6N2亚型和H11N9亚型AIV分离株的基因特征及遗传进化分析

作　者: 张兰兰
导　师: 华育平
学　校: 东北林业大学
专　业: 生理学
关键词: 野鸟源低致病性禽流感病毒 H6NZ亚型 HllN9亚型基因特征遗传进化分析基因重组
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 69次
引　用: 2次
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内容摘要

禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)在野生鸟类中分布广泛,特别是野生水禽被认为是禽流感病毒的天然储库,因此,野生鸟类在禽流感传播过程中具有不容忽视的作用。本研究分别将分离于黑龙江省三江国家级自然保护区的2株H6N2亚型野鸭源禽流感病毒[A/mallard/HeiLongjiang/131/2006(H6N2)、A/Mallard/SanJiang/113/2006(H6N2)]及分离于黑龙江省扎龙自然保护区的1株H11N9亚型东方白鹳禽流感病毒分离株[A/OrientalWhiteStork/ZhaLong/183/2006(H11N9)]进行了全基因组序列测定,并对其基因特征及遗传进化关系进行了比较分析。本试验在参考已知H6N2和H11N9亚型禽流感病毒基因组基因序列的基础上,设计合成各基因片段全长特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别成功扩增出上述3株禽流感病毒的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时分别将各基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树,并绘制了H6及H11亚型AIV全景进化树。结果表明：所克隆到的基因片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架。3株毒株的HA均有7个潜在糖基化位点；在HA裂解位点均无连续的多个碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。分离株各基因片段的遗传进化树分析表明分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过互相基因交换所形成的基因重组体。A/Mallard/SanJiang/113/2006(H6N2)分离株的PBl基因与青海H5N1分离株A/environment/Qinghai/1/2008(H5N1)亲缘关系最近,同源率高达99.9%。H6N2亚型分离株PA基因的进化树显示该基因与A/gadwall/Ohio/37/1999(H6N2)和A/duck/LA/32M/1987(H6N2)同属一支,共属于北美分支,而其它7个基因片段均属于欧亚分支,这表明禽流感病毒的自然地理分布情况比原来所公认的欧亚系和北美系的分布划分更要复杂。一般,由于地理分布的限制欧亚系和北美系基因片段的重组AIV是较少见的。本研究中的AIV分离株均有基因重组的现象发生,尤其是野鸭源三江H6N2分离株具有欧亚系和北美系基因片段重组的特性,可以推测与迁徙过程中携带各种不同亚型AIV的野鸟密切接触及各种不同亚型AIV的频繁感染有关,而这种在野鸟种群中连续性地或同时感染不同亚型低致病性流感病毒(LPAIV)是非常普遍的情况。本研究结论：野鸟源的低致病性AIV在自然界中普遍存在并不断发生着不同亚型AIVs的基因重排,所以应该对野鸟中LPAIV应给予足够的重视。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
1 绪论  11-20
  1.1 课题背景  11
  1.2 禽流感病毒的概况  11-13
    1.2.1 禽流感病毒的特征  11-12
    1.2.2 高致病力禽流感  12
    1.2.3 低致病力禽流感病毒  12
    1.2.4 LPAIV向HPAIV的转变  12-13
  1.3 AIV致病性的分子基础  13-15
    1.3.1 HA基因  13
    1.3.2 NA基因  13-14
    1.3.3 聚合酶复合体基因  14-15
    1.3.4 NP、M、NS基因  15
  1.4 野鸟在A型流感病毒进化与传播中的作用  15-18
    1.4.1 野生鸟类是A型流感病毒的天然储库  15-16
    1.4.2 野生鸟类中禽流感病毒的生态特点  16-17
    1.4.3 野生鸟类中禽流感病毒的生态分布  17-18
    1.4.4 野鸟中的H5N1亚型AIV  18
  1.5 本课题研究的目的和意义  18-20
2 材料和方法  20-26
  2.1. 实验材料  20-21
    2.1.1 病毒  20
    2.1.2 SPF鸡胚及鸡红细胞  20
    2.1.3 实验试剂  20
    2.1.4 实验仪器  20
    2.1.5 特异性引物  20-21
  2.2 实验方法  21-26
    2.2.1 病毒的分离  21
    2.2.2 红细胞凝集试验(HA)  21
    2.2.3 病毒RNA的提取  21-22
    2.2.4 cDNA的合成  22
    2.2.5 全基因组PCR扩增  22-23
    2.2.6 PCR产物的克隆  23-24
    2.2.7 PCR方法鉴定重组质粒  24
    2.2.8 序列测定  24-25
    2.2.9 序列分析和遗传进化分析  25-26
3 实验结果  26-62
  3.1 RT-PCR检测结果  26-30
  3.2 全基因组测序结果  30-36
  3.3 核苷酸序列同源性比较  36-42
  3.4 编码氨基酸序列分析比较  42-45
    3.4.1 裂解位点分析  42
    3.4.2 潜在糖基化位点分析  42
    3.4.3 抗原表位预测  42-43
    3.4.4 AIV分离株基因特征  43-45
  3.5 遗传进化关系分析  45-61
  3.6 H6和H11亚型禽流感病毒中HA和NA组合情况  61-62
4 讨论  62-67
  4.1 OZL183/06、MHLJ131/06和MSJ113/06病毒株的序列分析  62-63
  4.2 抗原性分析  63
  4.3 分离株同源性及遗传进化分析  63-65
  4.4 H6和H11亚型禽流感病毒中HA和NA组合情况初探  65-67
5 结论  67-68
6 参考文献  68-75
7 攻读学位期间发表的学术论文  75-76
8 致谢  76-77

野鸟源H6N2亚型和H11N9亚型AIV分离株的基因特征及遗传进化分析

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