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禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选

作　者: 邬成业
导　师: 王爱萍
学　校: 郑州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 禽流感病毒 核衣壳蛋白 多肽合成 T细胞表位
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


禽流感(Avian Influenza AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的一种禽类全身性或呼吸器官性传染病。禽流感呈世界性流行,是目前影响世界养禽业的最严重疫病之一,它不仅给养禽业造成了巨大的危害,而且也能感染人并导致死亡,给人类的健康带来了巨大的威胁。针对禽流感流行的严峻状况和目前尚无治疗的特效药物,迫切需要研制一种能预防高致病性禽流感的广谱性疫苗,从而有效地预防和控制禽流感,促进畜牧业的迅发展,保障人们的身体健康。在禽流感病毒主要组成蛋白中,核衣壳蛋白(NP)基因在A型流感病毒中同源性较高,保守性较强,具有型特异性,因此建立在NP蛋白基础上的多肽疫苗对AIV的预防将更具有意义。参考Genbank上发表的H5型禽流感病毒(A/chicken/Henan/01/2004(H5N 1))基因序列,利用PCR方法从质粒T-NP上扩增NP基因,然后构建成重组表达质粒pET32a-NP并转化大肠杆菌Rosetta,经酶切及PCR方法鉴定筛选出阳性克隆。测序证明,目的基因正确插入表达载体,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集不同诱导时间的菌液进行SDS-PAGE,结果表明AIV NP基因在大肠杆菌中以可溶的形式高效表达,分子量约为70kD,且能与H5N1亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。将表达蛋白经镍柱纯化后作为抗原对2月龄鸡进行免疫,三免后测得免疫后鸡抗体效价达104以上。同时用计算机预测NP的T细胞抗原表位并利用固相多肽合成(SPPS)方法将其合成,分离免疫鸡的外周血单核细胞(PBMC)调整浓度至2×106个/mL铺96孔细胞培养板,过夜后将预测合成的多肽用PBS溶解后以20μg/孔加入细胞中,用加入终浓度为15μg/mL的ConA为阳性对照后,MTT法检测结果表明P1-2(NP36),P1-3(NP380),P3-9(NP155)反应效果较好,可能是禽流感病毒核衣壳蛋白T细胞抗原表位。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第一章 文献综述  10-24
  1.1 禽流感病毒的分子生物学研究进展  10-14
    1.1.1 禽流感病毒的基因组和编码蛋白的功能  11-14
  1.2 禽流感在世界范围的的发生与危害  14-16
  1.3 禽流感疫苗研究进展  16-20
    1.3.1 全病毒灭活疫苗  16-17
    1.3.2 亚单位疫苗  17-18
    1.3.3 基因重组活载体疫苗  18-19
    1.3.4 核酸疫苗  19
    1.3.5 反向遗传操作疫苗  19-20
    1.3.6 通用疫苗  20
    1.3.7 其他疫苗  20
  1.4 T细胞表位  20-23
    1.4.1 细胞表位的研究方法  20-21
    1.4.2 关于流感病毒T细胞表位的研究进展  21-23
  1.5 本章小结  23-24
第二章 禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的表达及纯化  24-47
  2.1 材料与方法  24-38
    2.1.1 质粒、菌种和试剂  24
    2.1.2 主要仪器设备  24-25
    2.1.3 主要液体试剂  25-28
    2.1.4 NP基因的扩增  28-30
    2.1.5 重组质粒的构建  30-34
    2.1.6 重组质粒的鉴定  34-35
    2.1.7 重组质粒pET32a-NP的原核表达  35-36
    2.1.8 最佳诱导条件的优化  36
    2.1.9 表达产物可溶性分析  36-37
    2.1.10 目的蛋白的纯化  37
    2.1.11 目的蛋白的抗原性分析  37-38
  2.2 结果  38-44
    2.2.1 AIV NP基因片段的PCR扩增结果  38
    2.2.2 重组表达质粒的PCR和酶切鉴定结果  38-39
    2.2.3 重组质粒pET32a-NP的测序鉴定及进化性分析  39-40
    2.2.4 AIV核衣壳蛋白在大肠杆菌中的诱导表达  40-42
    2.2.5 表达产物的可溶性分析  42-43
    2.2.6 表达产物的检测  43-44
  2.3 讨论  44-47
第三章 T细胞抗原表位的筛选  47-56
  3.1 材料与方法  47-51
    3.1.1 实验动物及主要试剂  47
    3.1.2 主要仪器  47
    3.1.3 主要溶液配制  47-48
    3.1.4 动物免疫  48
    3.1.5 效价测定  48-49
    3.1.6 T细胞表位预测  49
    3.1.7 PBMC的分离  49-50
    3.1.8 表位筛选  50-51
  3.2 结果及分析  51-54
    3.2.1 NP蛋白免疫后鸡产生抗体效价的测定  51
    3.2.2 多肽合成  51-52
    3.2.3 T细胞表位筛选  52-54
  3.3 讨论  54-56
第四章 研究总结  56-57
参考文献  57-61
附录A:英文缩略词表(Abbreviations)  61-63
作者简历  63
硕士在读期间撰写和已发表的论文  63-64
致谢  64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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