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牛副流感病毒3型山东分离株核衣壳蛋白表达鉴定、多抗制备及应用

作　者: 史鸿飞
导　师: 薛飞
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛副流感病毒3型 NP基因核衣壳蛋白表达多克隆抗体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

牛副流感病毒3型( Bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3 ),为副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒属(Respirovirus)的成员,是引起犊牛肺炎的主要病原之一,又称为运输热病毒。犊牛肺炎是一种临床常见的疾病,每年都给养牛业造成巨大的经济损失。自然感染BPIV3的牛症状表现变化很大:从无症状的感染到严重的呼吸道疾病。BPIV3感染在世界范围内流行,尤其是美洲和亚洲,不断有BPIV3感染的报道。目前我国对该病的研究较少,也没有相关的诊断试剂。牛副流感病毒3型至少含有6种蛋白,即核衣壳蛋白(NP)、P、M、F、HN和L等蛋白,其中NP蛋白含有病毒的主要种抗原决定簇和属抗原决定簇,能够诱发机体产生强有力的免疫。本研究参照已发表的牛副流感病毒3型(BPIV3)全基因组序列,在NP基因的保守区域设计了套式引物。用牛副流感病毒3型山东分离株抽提的RNA为模板,通过套式RT-PCR扩增了长1534bp的NP基因片段,克隆到pMD18-T载体上。对NP基因的测序结果表明本研究所用的BPIV3山东分离株(SD0835)的NP基因核苷酸序列与目前已报道的BPIV3其它毒株的NP基因核苷酸序列的最高同源率只有84%,利用副流感病毒3型的NP基因核苷酸序列构建的分子进化树分析表明本研究所用的BPIV3山东分离株为一新的基因型,即BPIV3c基因亚型。将测序鉴定正确的质粒酶切后回收目的片段,定向克隆到pET30a表达载体上,然后转化BL21表达菌,经过IPTG诱导表达,获得了以包涵体形式表达的重组核衣壳(NP)蛋白。利用Ni柱亲和层析法在变性条件下纯化重组NP蛋白,间接ELISA与免疫印迹试验检测表明纯化的重组NP蛋白具有良好的抗原性和特异性。应用纯化的重组NP蛋白包被ELISA板,对采自国内发生呼吸道病牛群的血清进行间接ELISA,结果检测到了阳性血清,检测结果与国外的标准试剂盒进行对比,符合率为92.8%。利用纯化复性后的重组NP蛋白通过腘淋巴结和皮下接种免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。间接ELISA和Werstern blotting检测结果表明所制备的多克隆抗体能够识别原核表达的NP蛋白和全病毒蛋白。间接ELISA结果表明重组NP蛋白的兔源多克隆抗体具有很高的效价,当抗体稀释度达到1:8192时,其检测结果仍为阳性。间接免疫荧光试验结果表明重组NP多克隆抗体能够识别牛副流感病毒3型在感染细胞中表达的NP蛋白,而且在稀释度为1:2560时仍具有识别能力。用BPIV3山东分离株接种小鼠,在第2天采取的肝、脾、肺、肾、气管等组织中分离到了病毒,用重组NP蛋白多克隆抗体经免疫荧光试验证实分离毒为BPIV3。本研究用大肠杆菌成功地表达了BPIV3山东分离株的NP基因,表达的重组NP蛋白具有良好的抗原性,可用于BPIV3血清抗体的检测。用重组NP蛋白免疫新西兰白兔制备的多克隆抗体具有良好的反应性,可以用于BPIV3的鉴定及相关研究。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
第一章引言  13-23
  1.1 牛副流感病毒3 型的形态与特征  13-14
  1.2 BPIV3 基因组和编码蛋白概述  14-17
  1.3 BPIV3 的流行病学  17
  1.4 BPIV3 的临床症状及病理变化  17
  1.5 BPIV3 的诊断  17-18
    1.5.1 病毒分离  17-18
    1.5.2 血凝抑制试验  18
    1.5.3 中和试验  18
    1.5.4 免疫荧光试验  18
    1.5.5 RT-PCR 检测方法  18
  1.6 BPIV3 的预防及控制  18-21
    1.6.1 病毒载体疫苗  19
    1.6.2 基因工程亚单位疫苗  19-20
    1.6.3 DNA 疫苗  20
    1.6.4 纳米颗粒疫苗  20-21
  1.7 BPIV3 作为病毒载体的研究  21-22
  1.8 研究目的和意义  22-23
第二章牛副流感病毒3 型山东分离株NP 基因的表达与鉴定  23-32
  2.1 材料和方法  23-26
    2.1.1 病毒、菌种和质粒、细胞、血清  23
    2.1.2 试剂  23
    2.1.3 引物设计与合成  23-24
    2.1.4 MDBK 细胞的培养与病毒基因组RNA 的提取  24
    2.1.5 NP 基因的RT-PCR 以及表达载体的构建与鉴定  24
    2.1.6 NP 基因的表达  24-25
    2.1.7 NP 蛋白表达形式的鉴定  25
    2.1.8 表达产物的纯化与复性  25
    2.1.9 表达产物的Western blotting 检测  25
    2.1.10 表达产物的间接ELISA 检测  25
    2.1.11 表达产物对两种其它牛病毒性疾病阳性抗体血清的交叉反应  25
    2.1.12 现地牛血清的重组NP 蛋白间接ELISA 检测与瑞典检测试剂盒的比较  25-26
  2.2 结果  26-30
    2.2.1 NP 基因的扩增  26
    2.2.2 NP 基因表达载体的酶切鉴定  26-27
    2.2.3 RT-PCR 扩增产物的序列测定  27
    2.2.4 NP 基因的序列分析  27
    2.2.5 表达蛋白在细菌中的存在形式  27-28
    2.2.6 表达蛋白的纯化与复性  28-29
    2.2.7 Western blotting 分析  29
    2.2.8 表达产物与空载体对标准血清间接ELISA 检测  29
    2.2.9 交叉反应试验  29-30
    2.2.10 表达产物检测牛血清并与瑞典检测试剂盒比较  30
  2.3 讨论  30-32
第三章牛副流感病毒3 型重组NP 蛋白多克隆抗体的制备及初步应用  32-41
  3.1 材料和方法  32-34
    3.1.1 病毒、细胞、BPIV3 重组NP 蛋白与实验动物  32
    3.1.2 试剂  32
    3.1.3 免疫程序  32-33
    3.1.4 血清的采集  33
    3.1.5 BPIV3 的 TCID50 的测定  33
    3.1.6 间接ELISA 检测多克隆抗体的效价  33
    3.1.7 间接ELISA 检测不同时期多克隆抗体的效价  33
    3.1.8 间接ELISA 检测多克隆抗体的特异性  33
    3.1.9 多克隆抗体的Western blotting 分析  33-34
    3.1.10 中和试验检测多克隆抗体的效价和活性  34
    3.1.11 间接免疫荧光试验检测制备的多克隆抗体  34
    3.1.12 重组NP 蛋白多克隆抗体对小鼠分离毒的鉴定试验  34
  3.2 结果  34-39
    3.2.1 BPIV3 的 TCID50 的测定  34-35
    3.2.2 间接ELISA 检测多克隆抗体效价  35-36
    3.2.3 间接ELISA 多克隆抗体效价变化  36-37
    3.2.4 多克隆抗体特异性的检测  37
    3.2.5 Western blotting 检测多克隆抗体  37-38
    3.2.6 间接免疫荧光试验（IFA）检测制备的多克隆抗体  38-39
    3.2.7 BPIV3 重组 NP 蛋白多抗对实验感染小鼠分离毒的鉴定结果  39
    3.2.8 多克隆抗体中和试验检测结果  39
  3.3 讨论  39-41
第四章结论  41-42
参考文献  42-49
附录  49-52
致谢  52-53
作者简历  53

牛副流感病毒3型山东分离株核衣壳蛋白表达鉴定、多抗制备及应用

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