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猪流感病毒和“猪—禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究

作　者: 彭亚平
导　师: 金梅林
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流感病毒拯救共转染禽流感病毒重配病毒致病力跨种传播
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

猪流感（Swine Influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine Influenza Virus,SIV）引起猪的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病。SIV不仅可感染猪,同时也具有感染禽等鸟类和人、马等其他哺乳动物的能力。而猪可被禽流感病毒（Avian InfluenzaVirus,AIV）和人流感病毒感染,是流感病毒基因重组或重配的“混合器”和流感病毒新流行毒株产生的“孵育器”,因而猪是流感病毒“禽-哺乳动物”种间传播链中重要的中间宿主。SIV及猪的这些特征决定了它们在流感病毒种间传播中具有不可替代的地位,SIV在流感病毒的流行、跨种传播等方面的研究以及在公共卫生上都具有重要意义。本研究利用流感病毒8质粒拯救系统成功拯救了一株猪流感病毒以及两株“猪-禽”流感重配病毒,并比较两株重配病毒与其亲本毒之间的毒力差异。这为研究评估“猪-禽”流感重配病毒的风险以及流感病毒跨种传播提供了一定依据。主要研究结果如下:1.H1N1亚型猪流感病毒的拯救利用流感病毒8质粒拯救系统成功拯救出了猪流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004（H1N1）（A/S/TJ/04）。将猪流感病毒8个基因节段经RT-PCR合成cDNA后,分别克隆到RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ双向表达载体pHW2000中,构建成8个重组质粒。用8个重组质粒共转染COS-1细胞,30小时后加入TPCK-胰酶至终浓度0.5μg/mL。共转染48～72h后收获COS-1细胞及其上清,经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚。收获死亡鸡胚尿囊液并继续用SPF鸡胚传3代,得到有感染性的病毒。经血凝、血凝抑制试验、测序分析、电镜观察等均证实了A/S/TJ/04猪流感病毒的成功拯救,这为进一步研究猪流感病毒基因组结构与功能的关系、流感跨种传播的机制以及构建新型猪流感疫苗株奠定了基础。2.“猪-禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究以流感病毒8质粒拯救系统为工具,分别将猪流感病毒毒株A/S/TJ/04的HA基因以及HA和NA基因用禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004（H5N1）（A/C/HB/04）的相应基因片段进行置换,构建了“7+1”型重配病毒T+H（HA）和“6+2”型重配病毒T+H（HA/NA）,并测定亲本毒和重配毒的EID₅₀。以BALB/c小鼠为动物实验模型,各种病毒以10⁶EID₅₀的病毒量对小鼠进行攻毒,观察小鼠的存活率和体重变化情况,并在攻读后第3、6、12天取小鼠心、肺、脾、直肠和脑,计算组织体重比（即比重）,利用抗原捕捉ELISA检测方法检测各器官的病毒含量。通过对各攻毒组的数据进行比较,比较亲本毒株和重配毒株对小鼠感染致病能力的差异。结果显示,重配毒株对小鼠的致病力介于两亲本毒之间,强于猪流感病毒A/S/TJ/04而弱于禽流感病毒A/C/HB/04,其中重配毒株T+H（HA/NA）的致病力又强于T+H（HA）。结果表明猪流感病毒A/S/TJ/04在获得禽流感病毒A/C/HB/04的HA或HA和NA基因后致病力和组织嗜性都有所增强,在跨种传播和病毒流行方面具有一定的风险性,但同时也具有一定的限制性。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-12
第1章文献综述  12-30
  1.1 猪流感病毒概述  12-20
    1.1.1 猪流感病毒的形态结构  12-14
    1.1.2 猪流感病毒在世界范围的流行情况  14-16
    1.1.3 猪流感病毒宿主特异性及其变异  16-18
    1.1.4 猪流感病毒的种间传播  18-20
  1.2 流感病毒的反向遗传操作技术  20-30
    1.2.1 流感病毒反向遗传操作技术的历史与发展  21-26
    1.2.2 流感病毒反向遗传技术的应用  26-30
第2章 H1N1亚型猪流感病毒的拯救  30-42
  2.1 前言  30
  2.2 目的和意义  30-31
  2.3 材料和方法  31-38
    2.3.1 材料  31-33
    2.3.2 方法  33-38
  2.4 结果与分析  38-39
    2.4.1 质粒共转染及病毒的拯救  38
    2.4.2 获救病毒在鸡胚中的传代  38
    2.4.3 获救病毒的测序鉴定  38-39
    2.4.4 获救病毒的电镜观察  39
  2.5 讨论  39-41
    2.5.1 8质粒拯救系统及其应用  39-40
    2.5.2 影响流感病毒拯救效率的因素  40
    2.5.3 关于获救病毒的鉴定  40-41
  2.6 结论  41-42
第3章 "猪-禽"流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究  42-58
  3.1 前言  42
  3.2 目的和意义  42-43
  3.3 材料和方法  43-47
    3.3.1 材料  43-44
    3.3.2 方法  44-47
  3.4 结果与分析  47-55
    3.4.1 病毒的拯救及血凝、血凝抑制鉴定  47
    3.4.2 获救病毒在鸡胚中的传代  47
    3.4.3 获救病毒的测序鉴定  47
    3.4.4 病毒EID_(50)的测定  47
    3.4.5 小鼠攻毒实验结果  47-51
    3.4.6 各器官中病毒含量比较  51-55
  3.5 讨论  55-57
    3.5.1 亲本毒株的选择  55-56
    3.5.2 重配病毒在鸡胚上的增殖  56
    3.5.3 各毒株对小鼠致病性的比较  56-57
  3.6 结论  57-58
参考文献  58-63
致谢  63-64
附录  64

猪流感病毒和“猪—禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究

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