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禽流感病毒M2e基因多拷贝串联体的原核表达及免疫原性研究

作　者: 侯红岩
导　师: 侯继波；姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒基质蛋白2 M2e抗体 CD4~+T cells CD8~+T cells
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

高致病性禽流感（HPAI）是由H5和H7亚型禽流感病毒（AⅣ）引起的禽类急性高致病性传染病,被国际兽疫局（OIE）列为A类疾病,在我国被列为一类传染病。防控禽流感最有效的措施是免疫接种,但由于禽流感病毒容易变异,存在众多的血清亚型,并且各亚型之间没有交叉保护力,当前使用的疫苗必须在每年流行之前更新换代。因此,研制一种可以抵抗多种亚型禽流感病毒的“通用型”疫苗是当务之急。禽流感病毒基质蛋白2的膜外部分（M2e）在各个亚型之间高度保守,能够引起交叉保护,是研究“通用型”禽流感疫苗理想的靶抗原。将人工合成M2e基因（H9N2）与质粒pET-32a-M2e-Fc（H5N1）中的M2e-Fc基因串联至psIMPLE载体中,并利用同尾酶将串联体进行多拷贝的重复,最终成功构建含1、2、3、4、5、6拷贝M2e串联体的克隆载体,并将多拷贝的串联体亚克隆至表达载体pET-32a中,经过酶切鉴定和测序,证实其插入的片断大小、读码框架正确,结果获得6个表达载体,分别命名pET-（H9M2e-H5M2e）₁-FcpET-（H9M2e-H5M2e）₂-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）₃-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）₄-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）₅-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）₆-Fc。将6种表达载体转化BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,结果为6个重组质粒表达蛋白相对分子量分别约为40.9、47.0、53.1、59.3、65.3和71.4 kDa。将2、4和6拷贝基因重组质粒表达蛋白通过镍亲和层析,结果得到纯化的融合蛋白（H9M2e-H5M2e）₂-Fc、（H9M2e-H5M2e）₄-Fc、（H9M2e-H5M2e）₆-Fc,分别简写4M2e、8M2e和12M2e,经Western-blotting鉴定融合蛋白具有良好的抗原性,为研究重组蛋白的免疫原性奠定了基础。利用纯化的3种重组蛋白4M2e、8M2e和12M2e分别与弗氏佐剂、白油佐剂和CpG佐剂进行乳化制备疫苗,取21日龄AⅣ阴性鸡分组进行动物免疫实验。其中三种蛋白分别与弗氏佐剂乳化分别为A、B和C组,蛋白12M2e与白油佐剂、CpG佐剂分别为D、E组,12M2e的全菌蛋白为F组,阴性组为G组,每组10只,免疫方式为肌肉注射,免疫剂量为50ug/只鸡,免疫两次,首免3周后加强免疫。首免后每周采血,用间接ELISA方法检测M2e特异性抗体滴度;分别在首免3周、加强免疫后2周与4周检测外周血淋巴细胞的CD4⁺与CD8⁺T细胞所占的比例;选取高滴度抗体试验组的血清进行了鸡胚中和试验、细胞病变试验和间接免疫荧光试验。结果显示,各实验组均产生了较高滴度的M2e特异性抗体,12M2e蛋白与弗式佐剂乳化疫苗组产生的抗体滴度最高,M2e特异性抗体在一定程度上能够中和H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚,并且这种抗体能够与表达在感染禽流感病毒的MDCK细胞表面的M2e发生反应,抑制MDCK细胞上病毒的释放。

禽流感病毒M2e基因多拷贝串联体的原核表达及免疫原性研究

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