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犬星状病毒（Canineastrovirus，CaAstv）半巢式RT-PCR检测方法的建立及基因序列分析

作　者: 朱爱玲
导　师: 崔立
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬星状病毒 半套式RT-PCR 序列分析 P1蛋白 原核表达
分类号: S858.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


犬星状病毒是无囊膜的单股正链RNA病毒,呈五角或六角的星形,可引起犬呕吐、腹泻、发热等症状,对犬的健康造成威胁。因此建立一种敏感、特异的犬星状病毒的PCR检测方法具有重要意义。本文从犬星状病毒半套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用、病毒基因组序列扩增及分析、P1蛋白的表达纯化等方面进行了系统研究,结果如下:本研究根据GenBank上发表的犬星状病毒ORF2序列5′端保守区设计特异性引物,通过反应条件的优化、特异性实验和敏感性实验,建立了敏感、快速、准确的半套式RT-PCR检测方法。PCR反应的目的片段为ORF2序列5′端保守区的RNA片段,大小为480bp。优化50ul反应体系中,最适引物终浓度为0.24umol/L、最适dNTP浓度为0.4mM、Mg2+浓度为1.5mmol/L、Taq酶浓度为0.05U/ul,退火温度为56℃。与犬细小病毒、犬轮状病毒、犬博卡病毒均无特异性反应。利用建立的半套式RT-PCR检测方法对上海地区321份新鲜采集的犬粪便样品（183份腹泻样品和138份健康样品）进行初步检测。结果显示:腹泻样品中共有22份阳性,阳性率为（12.02%）,健康犬粪样中未检测到星状病毒。进化树及同源性分析发现,犬星状病毒中国株与犬星状病毒意大利株分为不同的簇,表明犬星状病毒中国株可能为一种新毒株。试验表明,本研究建立的半套式RT-PCR方法可用于临床粪便样品的检测,具有敏感、快速、准确的特点,该方法的建立为犬星状病毒感染的临床快速诊断提供了科学依据。根据犬星状病毒GenBank已知序列信息共设计4对引物,结合LA PCRTM和Genome Walking等技术对其中一株病毒的基因序列进行扩增,并对该株病毒的基因序列进行分析。结果显示:本研究扩增出5011bp的基因片段,包括完整的ORF2基因（2475bp）、完整的ORF1b基因（1536bp）以及部分ORF1a基因（1198bp）。将具有抗原表位的ORF2基因5′端保守区RNA片段（P1）,克隆到原核表达载体pET-30a上,经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,用终浓度为1mmol.L-1 IPTG诱导,表达产物以包涵体形式存在。超声波裂解菌体后对包涵体进行溶解,再用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化,并对纯化的蛋白进行复性,为下一步ELISA检测方法的建立奠定了基础。

全文目录


摘要  2-4
ABSTRACT  4-7
符号说明  7-12
第一章 文献综述  12-28
  1 星状病毒的研究进展  12-13
  2 病原学  13-17
    2.1 分类  13
    2.2 形态学  13-14
    2.3 生物学特性  14-15
    2.4 分子病原学  15-16
    2.5 致病性  16-17
  3 流行病学  17-19
    3.1 流行概况  17-19
    3.2 传播途径  19
  4 临床症状与病理变化  19-21
    4.1 临床症状  19-20
    4.2 病理变化  20-21
  5 检测方法  21-26
    5.1 电镜直接观察法  21
    5.2 细胞培养和组织分离  21
    5.3 免疫学检测技术  21-22
      5.3.1 免疫荧光技术(immunofluorescence)  21-22
      5.3.2 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay; ELISA）  22
    5.4 分子生物学检测  22-26
      5.4.1 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）  22-23
      5.4.2 实时荧光定量RT-PCR法  23-24
      5.4.3 环介导等温扩增技术  24-25
      5.4.4 基因芯片  25-26
      5.4.5 核酸序列依赖扩增技术 ( nucleic acidsequence based amplification ， NASBA)  26
  6 治疗与预防  26
  7 研究展望  26-27
  8 本研究的目的和意义  27-28
第二章 犬星状病毒半巢式RT-PCR检测方法的建立及应用  28-42
  1 材料  28-29
    1.1 粪便样本  28
    1.2 病毒样品  28-29
    1.3 主要试剂  29
    1.4 主要仪器  29
  2 实验方法  29-31
    2.1 引物的设计与合成  29-30
    2.2 病毒总RNA的提取  30
    2.3 cDNA的合成  30-31
  3 半巢式RT-PCR方法的建立  31-33
    3.1 半巢式RT-PCR条件的优化  31-32
      3.1.1 最适模板浓度的确定  31
      3.1.2 最适引物使用量的确定  31
      3.1.3 最适Taq酶浓度的确定  31
      3.1.4 最适退火温度的确定  31
      3.1.5 最适Mg2+浓度的确定  31-32
      3.1.6 最适dNTP浓度的确定  32
    3.2 PCR扩增体系与循环参数  32
    3.3 扩增产物的检测与分析  32
    3.4 PCR特异性试验  32-33
    3.5 PCR敏感性试验  33
    3.6 PCR重复性实试验  33
    3.7 半巢式RT-PCR检测方法的应用  33
  4 结果  33-40
    4.1 最佳的PCR反应条件  33-36
    4.2 扩增产物的检测与序列分析  36-38
    4.3 PCR方法特异性试验  38
    4.4 PCR方法敏感性试验  38-39
    4.5 重复性试验  39
    4.6 临床样品的检测  39-40
  5 讨论  40-42
第三章 犬星状病毒ORF1B和ORF2扩增及序列分析  42-59
  1 技术原理  42-44
  2 引物设计  44-45
  3 反应条件  45-48
    3.1 cDNA的合成  45
    3.2 长片段扩增反应条件  45-46
    3.3 染色体步移技术  46-48
      3.3.1 1st PCR 反应  46-47
      3.3.2 2nd PCR反应  47
      3.3.3 3rd PCR反应  47-48
  4 结果  48-54
    4.1 测序结果的拼接  48-52
      4.1.1 犬星状病毒ORF2序列信息  48-49
      4.1.2 犬星状病毒ORF1b序列信息  49-51
      4.1.3 犬星状病毒部分ORF1a序列信息  51-52
    4.2 系统进化树分析  52-54
  5 ORF2编码氨基酸差异分析  54-55
  6 ORF2衣壳蛋白二级结构及B细胞表位预测  55-57
  7 讨论  57-59
第四章 犬星状病毒P1蛋白的原核表达及纯化  59-76
  1 材料  59-60
    1.1 病毒、菌株和质粒  59
    1.2 主要试剂  59-60
    1.3 主要仪器  60
  2 实验方法  60-68
    2.1 目的基因的扩增、纯化和回收  60-63
      2.1.1 引物的设计与合成  60-61
      2.1.2 目的基因的PCR扩增  61-62
        2.1.2.1 cDNA的合成  61
        2.1.2.2 PCR扩增  61-62
      2.1.3 目的片段的纯化回收  62-63
    2.2 目的基因的克隆  63-65
      2.2.1 克隆质粒的构建  63
      2.2.2 克隆质粒的筛选及制备  63-65
        2.2.2.1克隆质粒的转化与筛选  63
        2.2.2.2 重组质粒的提取及鉴定  63-65
    2.3 P1基因原核表达载体（pET-30a-P1）的构建  65-66
      2.3.1 带粘性末端P1核苷酸片段的制备  65
      2.3.2 带粘性末端表达载体的制备  65
      2.3.3 目的基因与线性化表达载体pET-30a的连接  65
      2.3.4 连接产物的转化和阳性重组子的筛选鉴定  65-66
    2.4 重组表达载体诱导表达的鉴定  66
    2.5 重组质粒pET-30a-P1诱导原核表达条件优化  66-67
      2.5.1 不同诱导时间对重组质粒pET-30a-P1表达的影响  66-67
      2.5.2 不同诱导温度对重组质粒pET-30a-P1表达的影响  67
    2.6 重组质粒pET-30a-P1原核表达产物可溶性分析  67
    2.7 表达产物的纯化  67-68
      2.7.1 包涵体的分离和变性  67
      2.7.2 目的蛋白的纯化  67-68
    2.8 表达产物的复性  68
  3 结果  68-74
    3.1 P1基因的PCR结果  68-69
    3.2 目的片段的克隆鉴定  69
    3.3 原核重组表达载体的鉴定  69
    3.4 P1蛋白原核表达的鉴定  69-70
    3.5 重组质粒pET-30a-P1阳性BL21(DE3)菌诱导表达条件的优化  70-72
      3.5.1 重组载体诱导表达时间的优化  70-71
      3.5.2 重组载体诱导表达温度的优化  71-72
    3.6 蛋白的可溶性分析  72-73
    3.7 蛋白的纯化  73-74
  4 讨论  74-76
第五章 结论  76-77
参考文献  77-84
附录Ⅰ 试剂配置  84-86
致谢  86-87
攻读学位期间发表的学术论文目录  87-89

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 犬
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