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转脂质转运蛋白基因山新杨抗逆性分析

作　者: 李健
导　师: 刘桂丰
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 脂质转运蛋白基因逆境胁迫原核表达转基因杨树
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

脂质转运蛋白是植物体内一种重要的防御蛋白,在抵抗和适应外界胁迫中有着重要的作用。本实验室已成功建立了在0.4 mol/L的NaCl溶液胁迫条件下刚毛柽柳根的cDNA文库,通过对柽柳cDNA文库克隆的随机测序,获得的ThLTP基因的cDNA序列,全长635 bp,其中5’非编码区129 bp,3’非编码区155 bp,开放阅读框(ORF)为351 bp,编码116个氨基酸。采用荧光定量PCR技术探讨了ThLTP在盐胁迫、冷胁迫、干旱胁迫、重金属胁迫以及ABA诱导条件下的表达模式,结果证明：ThLTP基因能够对NaCl、ABA, PEG和重金属隔(Cd)胁迫产生应答反应,显著呈上调表达,并且其在根中的表达量明显高于地上组织中的表达量；而冷胁迫则抑制了该基因在柽柳根中的表达。因而我们推测ThLTP是一个NaCl、PEG和重金属隔(Cd)逆境胁迫相关的基因,其表达受ABA诱导。将ThLTP构建原核表达载体,进行该基因的原核表达研究,建立了最佳原核表达体系,即30℃条件下0.2 mmol/L IPTG诱导5 h,重组菌株BL21 (pET32a-LTP)表达量达到最高。进而对重组菌株BL21 (pET32a-LTP)进行了逆境胁迫。结果表明,在NaCl和PEG胁迫条件下的生长曲线分析表明,重组菌株BL21 (pET32a-LTP)能显著提高大肠杆菌抵御非生物胁迫的能力,证实ThLTP是一个与抗旱耐盐相关的基因。为了进一步验证ThLTP在盐胁迫下的功能,将ThLTP基因用农杆菌介导法转化山新杨,共获得卡那霉素抗性株系20个,其中有10个株系经PCR验证为阳性。从10个株系中选择9个株系(S7、S9、S12、S13、S14、S15、S19、S30、S44)做进一步Northern检测,结果证明该基因已成功地整合到山新杨基因组中,并转录出相应的产物。将转基因山新杨和非转基因对照植株分别接种到含有0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L NaCl的培养基中培养20 d后,过量表达ThLTP的转基因山新杨植株生长状态好于对照植株。对200 mmol/L NaCl胁迫下叶片分化率、平均增重、生根率、盐害指数的综合分析得出,抗盐性从强倒弱排序：S14>S19>S9>S30>S12>S7>S44>CK。转基因植株叶片抗盐迫分析表明,0.8%NaCl胁迫3d、4d后各转基因株系叶绿素含量显著地高于非转基因对照植株叶绿素含量,其平均值高于对照的79.3%；各转基因株系相对电导率显著低于非转基因对照植株的电导率,其平均值低于对照的28.2%。由此可见,盐胁迫条件下,转基因山新杨受害程度明显小于对照,其中转基因株系S9、S14、S19较好,受到的伤害较小。转基因山新杨中过量表达ThLTP在逆境条件下对膜系统有保护作用,减轻质膜损伤,具有更强的抗盐胁迫能力。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 绪论  9-17
  1.1 LTP的研究进展  9-13
    1.1.1 LTP的生化特点  9-10
    1.1.2 LTP的分类  10
    1.1.3 LTP基因的克隆与表达  10-11
    1.1.4 植物LTP的生物学功能  11-13
  1.2 LTP与环境胁迫的关系  13-15
    1.2.1 冷胁迫诱导LTP的表达  13
    1.2.2 盐胁迫诱导LTP的表达  13-14
    1.2.3 干旱胁迫与植物LTP基因的关系  14-15
  1.3 研究的目的和意义  15
  1.4 研究的内容和技术路线  15-17
    1.4.1 研究内容  15-16
    1.4.2 技术路线  16-17
2 柽柳脂质转移蛋白基因(ThLTP)逆境胁迫及ABA诱导下的表达分析  17-27
  2.1 材料和方法  17-19
    2.1.1 材料的处理  17-18
    2.1.2 ThLTP基因的生物信息学分析  18
    2.1.3 CTAB法提取柽柳总RNA  18-19
    2.1.4 总RNA反转录合成cDNA  19
    2.1.5 实时定量RT-PCR分析ThLTP基因的表达分析  19
  2.2 结果与分析  19-25
    2.2.1 ThLTP的生物信息学分析  19-22
    2.2.2 柽柳总RNA的质量  22
    2.2.3 NaCl胁迫处理下ThLTP的表达分析  22-23
    2.2.4 重金属镉(Cd)胁迫处理下ThLTP的表达分析  23
    2.2.5 干旱胁迫处理下ThLTP基因的表达分析  23-24
    2.2.6 冷胁迫处理下ThLTP的表达分析  24
    2.2.7 ABA诱导下柽柳ThLTP的表达分析  24-25
  2.3 结论与讨论  25-27
3 BL21(pET32a-LTP)的诱导表达与抗逆性分析  27-35
  3.1 材料  27
    3.1.1 菌株和质粒  27
    3.1.2 酶和试剂  27
    3.1.3 主要仪器设备  27
  3.2 方法  27-29
    3.2.1 LTP基因的PCR扩增  27-28
    3.2.2 原核表达载体的构建  28
    3.2.3 重组蛋白的诱导表达  28-29
    3.2.4 BL21(pET32a-LTP)的抗逆性分析  29
  3.3 结果与分析  29-33
    3.3.1 BL21(pET32a-LTP)重组质粒的获得  29-30
    3.3.2 BL21(pET32a-LTP)的诱导表达  30-32
    3.3.3 BL21(pET32a-LTP)的抗逆性分析  32-33
  3.4 结论与讨论  33-35
4 LTP基因山新杨的遗传转化及抗逆性分析  35-55
  4.1 实验材料  35-36
    4.1.1 植物材料  35
    4.1.2 菌株和质粒  35
    4.1.3 酶和试剂  35
    4.1.4 培养基  35-36
  4.2 实验方法  36-41
    4.2.1 ThLTP植物表达载体的构建  36
    4.2.2 工程菌的制备  36-37
    4.2.3 根癌农杆菌介导的山新杨遗传转化  37
    4.2.4 转基因山新杨的PCR检测  37-38
    4.2.5 转基因山新杨Northern印迹杂交  38-40
    4.2.6 转基因山新杨组培苗的NaCl胁迫处理  40-41
    4.2.7 隶属函数法综合评定耐盐性  41
  4.3 结果与分析  41-43
    4.3.1 pLTP植物表达载体的获得  41-42
    4.3.2 工程菌的获得及遗传转化  42-43
    4.3.3 转ThLTP山新杨的获得  43
  4.4 转ThLTP山新杨的耐盐性分析  43-53
    4.4.1 NaCl胁迫下转基因山新杨质膜损伤比较  45-46
    4.4.2 NaCl胁迫下转基因山新杨叶绿素含量的变化  46-47
    4.4.3 NaCl胁迫下转基因山新杨叶片分化情况比较  47-48
    4.4.4 NaCl胁迫下转基因山新杨组培苗生长比较  48-52
    4.4.5 转基因山新杨的耐盐性提高  52
    4.4.6 综合评价转基因山新杨耐盐性  52-53
  4.5 结论与讨论  53-55
结论  55-57
参考文献  57-67
附录  67-69
攻读学位期间发表的学术论文  69-70
致谢  70-71

转脂质转运蛋白基因山新杨抗逆性分析

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