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Galectin-1在高糖腹透液诱导人腹膜间皮细胞转分化中的作用

作　者: 戴洪勤
导　师: 刘映红
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: galectin-1 高糖腹透液上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT) siRNA EMT
分类号: R459.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景：腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是肾脏替代治疗三种方式之一。超滤衰竭(Ultrafiltration Failure,UFF)是腹膜透析病人退出治疗的最主要的原因之一。已有大量研究证实,高浓度的葡萄糖腹透液引起腹膜形态和功能的改变,腹膜细胞的损伤和修复甚至细胞向间充质细胞转分化(Epithelial-to-mesenchymal Transition,EMT),最终导致腹膜纤维化(Peritoneal fibrosis,PF)和超滤衰竭的发生。但目前关于腹膜纤维化的分子机制仍未完全阐明。Galectin-1是第一个被报道的哺乳动物半乳糖凝集素,参与细胞的粘附、增殖、分化、凋亡,炎症反应等多种生理、病理过程,并在免疫系统及肿瘤发生、发展中发挥重要作用。我们以往的研究通过蛋白组学方法发现高糖刺激腹膜间皮细胞后galectin-1表达明显上调,推测galectin-1可能在腹膜纤维化某一环节起作用。最新的研究报道发现galectin-1通过阻断TGF-β/Smad通路抑制肾小管上皮细胞胶原Ⅰ的表达,但galectin-1在高糖腹透液诱导体外腹膜间皮细胞EMT的表达及与EMT的关系国内外尚未见报道。vimentin和zo-1是常用的EMT相关的指标。波形蛋白(vimentin)是间质细胞中最主要的中间纤维,它存在于中胚层起源的细胞中,如成纤维细胞、内皮细胞和白细胞等,并与微管、微丝共同形成了一个细胞支架网络而维持细胞完整性。紧密连接相关蛋白1(zonula occluden-1,ZO-1)则是组成紧密连接的支架,是维持血管和腹透液两侧渗透压梯度的相关结构。Vimentin的表达增加和zo-1的表达丢失提示细胞可能发生EMT。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,DsRNA)诱导与之同源的mRNA降解,从而引发的转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene Silencing,PTGS),目前已成功用于基因功能和信号传递系统上下游分子相互关系的研究,有可能成为继反义核酸,核酶之后的又一新手段。目的：通过观察不同浓度葡萄糖腹透液对腹膜间皮细胞(HPMC)galectin-1及EMT相关指标vimentin、zo-1表达的影响,初步探讨galectin-1与EMT的关系。方法：以人腹膜间皮细胞株为研究对象,随机分为4组：正常对照组(5.5mmol/L),1.5%PDS组,2.5%PDS组及4.25%PDS组。采用实时定量PCR(Real-time PCR)测定galectin-1,vimentin和zo-1mRNA水平的表达；采用蛋白印迹(Westem-blot)方法,测定galectin-1,vimentin和zo-1蛋白水平的表达。分析galectin-1与Vimentin,zo-1表达的相关性。结果：(1)正常培养条件下,HPMC表达galectin-1,仅表达少量的vimentin和一定量的zo-1。(2)4.25%PDS刺激HPMC不同时间,galectin-1蛋白表达量逐渐增高,12h,24h,48h galectin-1的蛋白表达量分别为对照组的1.09倍,1.22倍和1.42倍,均有统计学意义(P<0.05)。72h galectin-1的蛋白表达量较前稍下降,为对照组的1.37倍,与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。(3)不同浓度葡萄糖腹透液刺激HPMC galectin-1 mRNA和蛋白水平的表达逐渐增高,呈浓度依赖性。Galectin-1 mRNA表达量分别为对照组的1.22倍,1.535倍和2.34倍(P<0.05)。1.5%PDS组,2.5%PDS组,4.25%PDS组galectin-1的蛋白表达量分别为对照组的1.48倍,2.01倍和2.38倍,与对照组相比较,均有统计学差异(P<0.05)。(4)高糖PDS刺激HPMC48h后,vimentin mRNA和蛋白水平表达显著上调,呈浓度依赖性。与对照组相比较,vimentin mRNA的表达分别为对照组的1.16倍,1.27倍和1.69倍(P<0.05)。vimentin蛋白表达量分别为对照组的1.28倍,1.51倍和1.92倍(P<0.05)。(5)高糖PDS刺激HPMC48h后,zo-1 mRNA和蛋白水平表达显著下调,呈浓度依赖性。与对照组相比较,zo-1 mRNA的表达分别为对照组的77%,43%(P<0.05)和20%(P<0.05)。zo-1蛋白表达量分别为对照组的88%,52%(P<0.05)和40%(P<0.05)。(6)galectin-1 mRNA表达与vimentin mRNA表达呈正相关(r=0.864,P<0.05),与zo-1 mRNA表达呈负相关(r=-0.604,P<0.05)；galectin-1蛋白水平表达与vimentin蛋白水平表达呈正相关(r=0.917,P<0.05);galectin-1蛋白水平表达与zo-1蛋白表达呈负相关(r=-0.869,P<0.05)结论：(1)galectin-1在人腹膜间皮细胞(HPMCs)有表达,高糖腹透液能上调galectin-1的表达,且呈浓度和时间依赖性。(2)高糖腹透液能诱导HPMCs发生转分化。(3)galectin-1与高糖腹透液诱导HPMCs转分化相关。目的：转染galectin-1 siRNA抑制人腹膜间皮细胞galectin-1的表达,检测vimentin、zo-1的表达,观察galectin-1 siRNA能否抑制高糖腹透液诱导的HPMCs转分化。方法：以脂质体法转染siRNA至HPMC,把HPMC分为3组：正常对照组(未转染HPMC+5.5mmol/L葡萄糖),高糖组(未转染HPMC+4.25%高糖PDS刺激组)和转染组(转染galectin-1 siRNA的HPMC+4.25%高糖PDS刺激)。采用实时定量PCR(Real-timePCR)测定galectin-1,vimentin和zo-1mRNA水平的表达;采用蛋白印迹(Westem-blot)方法,测定galectin-1, vimentin和z0-1蛋白水平的表达。结果：(1)4.25%高糖PDS刺激HPMCs 48h, galectin-1 mRNA及蛋白的表达较正常对照组均显著上调(P<0.05)。vimentin mRNA及蛋白表达较正常对照组上调,zo-1 mRNA及蛋白表达较正常对照组下调,均有统计学差异(P<0.05)。(2)galectin-1 siRNA转染入HPMCs后,与高糖刺激组相比较,galectin-1 mRNA及蛋白的表达均被抑制(P<0.05),同时vimentin mRNA及蛋白表达明显下调,zo-1 mRNA及蛋白表达明显上调,均有统计学差异(P<0.05)。结论：galectin-1 siRNA可以减轻高糖腹透液诱导的腹膜间皮细胞EMT的程度。

全文目录

中文摘要  4-9
英文摘要  9-17
英文缩略词简表  17-18
论文正文  18-48
  第一章 galectin-1在不同浓度腹透液刺激下的表达及EMT的关系  18-39
    1.1 材料与方法  20-29
    1.2 结果  29-35
    1.3 讨论  35-38
    1.4 小结  38-39
  第二章转染galectin-1 siRNA对腹膜间皮细胞EMT的影响  39-48
    2.1 材料与方法  39-41
    2.2 结果  41-44
    2.3 讨论  44-47
    2.4 小结  47-48
全文总结  48-49
参考文献  49-52
综述  52-67
致谢  67-68
攻读学位期间主要研究成果  68

Galectin-1在高糖腹透液诱导人腹膜间皮细胞转分化中的作用

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