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目的:观察高糖和波动性高糖干预人脐静脉内皮细胞株(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)后,上清液中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活力的变化;蛋白激酶Cα(Protein kinase Cα,PKCα)、蛋白激酶Cβ2(Protein kinase Cβ2,PKCβ2)以及SelS在mRNA及蛋白水平表达的差异。探讨高糖对HUVECs的损伤是否通过PKC通路发挥作用,及此通路与SelS的关系,为研究内皮细胞保护策略提供新的研究依据。方法:1.分别用含D-葡萄糖为5.5mM (Normal glucose group,NG)、20mM(High glucose group,HG)、5.5mM与20mM隔日交替(Intermittent glucose group,IG)及含14.5 mM甘露醇(Mannitol group,MG)培养液中孵育HUVECs 2天、7天以及14天,观察各组细胞形态学变化,取各组细胞上清液,用硫代巴比妥酸法测定MDA的含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活力。2.按照方法1干预HUVECs,分别于2天、7天、14天后提取各组细胞总RNA,采用实时定量PCR的方法测定各组细胞的SelS及PKCα、PKCβ2在mRNA水平的表达。3.按照方法1干预HUVECs,分别于2天、7天、14天后提取各组细胞总蛋白,采用Western blot的方法检测SelS及PKCα、PKCβ2在蛋白水平的表达。结果:1.细胞形态学变化:细胞分别暴露于含不同浓度葡萄糖的培养液中培养2天后,在倒置显微镜下观察,NG和MG细胞轮廓清晰,多呈梭形,胞质胞核清晰可见;HG细胞轮廓尚清楚,胞质增多,胞体增大,呈铺路石样,IG细胞形态与高糖组相似;7天后,NG和MG细胞形态与2天基本相同,HG细胞数量明显减少,细胞轮廓模糊不清,胞质明显增多,胞体细长,呈枯树枝样,IG细胞变化更加明显;14天后,NG和MG细胞形态良好,HG细胞数量减少更加明显,IG细胞变化较HG更加明显。2.MDA含量(nmol/ml):干预2天后,HG(5.15±0.32)和IG(5.17±0.14)分别与NG(1.10±0.20)和MG(1.12±0.17)相比,MDA含量显著升高(P=0.004,P=0.003;P=0.002,P=0.003),HG与IG相比无显著差异(P>0.05);干预7天后,HG(8.44±0.44)和IG(10.86±0.36)较NG(1.07±0.15)和MG(1.09±0.14)MDA含量显著升高(P=0.008,P=0.004;P=0.003,P=0.003),且IG比HG升高更加明显(P=0.002);干预14天后,HG(11.92±0.38)和IG(15.66±0.56)分别与NG(1.18±0.21)和MG(1.15±0.20)相比,MDA含量显著升高(P=0.006,P=0.005;P=0.004,P=0.003),且IG比HG升高更加明显(P=0.003)。各时间段,NG和MG相比都无明显差异(P>0.05)。随着时间的延长,HG和IG组MDA含量7天较2天明显升高(P=0.006;P=0.003),14天较7天显著升高(P=0.004,P=0.002)。3.SOD活力(U/ml):干预2天后,HG(27.76±0.40)和IG(26.45±0.49)分别与NG(34.41±1.05)和MG(34.32±0.98)相比,SOD活力显著降低(P=0.003,P=0.002;P=0.00,P=0.00),HG与IG相比无显著差异(P>0.05);干预7天后,HG(20.27±0.52)和IG(16.29±0.38)较NG(34.33±1.04)和MG(34.40±0.99)SOD活力显著减弱(P=0.006,P=0.004;P=0.003,P=0.002),且IG比HG降低更明显(P=0.002);干预14天后,HG(10.36±0.45)和IG(5.81±0.45)分别与NG(34.33±1.04)和MG(34.33±0.95)相比,SOD活力显著降低(P=0.004,P=0.003;P=0.002,P=0.005),且IG比HG降低更明显(P=0.001)。不论2天,7天还是14天,NG和MG相比都无差异(P>0.05)。随着时间的延长,HG和IG组SOD活力7天较2天明显降低(P=0.008,P=0.004),14天较7天显著降低(P=0.006,P=0.003)。4.SelS mRNA的表达:干预2天后,HG(0.80±0.03)和IG(0.87±0.05)与NG(0.71±0.02)和MG(0.72±0.03)相比,SelS mRNA表达显著升高(P=0.01,P=0.002;P=0.006,P=0.001),且IG高于HG(P=0.03);干预7天后,HG(0.95±0.08)和IG(1.09±0.03)较NG(0.82±0.04)和MG(0.82±0.02)SelS mRNA表达显著升高(P=0.01,P=0.00;P=0.002,P=0.004),且IG比HG升高更加明显(P=0.01);干预14天后,HG(1.07±0.03)和IG(1.16±0.02)分别与NG(0.91±0.03)和MG(0.90±0.03)相比,SelS mRNA表达显著升高(P=0.008,P=0.004;P=0.003,P=0.003),且IG比HG升高更加明显(P=0.003)。随着时间的延长,HG和IG组SelS mRNA的表达7天较2天明显升高(P=0.02,P=0.03),14天较7天显著升高(P=0.03,P=0.046)。5.SelS蛋白水平的表达:干预2天后,HG(0.51±0.02)和IG(0.58±0.04)分别与NG(0.37±0.05)和MG(0.36±0.03)相比,SelS在蛋白水平的表达明显升高(P=0.02,P=0.00;P=0.00,P=0.00),且IG高于HG(P=0.04);干预7天后,HG(0.63±0.02)和IG(0.75±0.03)较NG(0.53±0.05)和MG(0.53±0.02)明显升高(P=0.006,P=0.004;P=0.003,P=0.002),且IG比HG升高明显(P=0.002);干预14天后,HG(0.85±0.03)和IG(1.01±0.04)分别与NG(0.56±0.05)和MG(0.55±0.04)相比,SelS在蛋白水平的表达显著升高(P=0.004,P=0.003;P=0.002,P=0.005),且IG比HG升高更加明显(P=0.003)。随着时间的延长,HG和IG组SelS在蛋白水平的表达7天较2天明显升高(P=0.02,P=0.03),14天较7天显著升高(P=0.03,P=0.04)。6.PKCαmRNA和蛋白水平的表达:各时间段、各组PKCαmRNA和蛋白水平的表达均无统计学差异(P>0.05)。7.PKCβ2 mRNA水平的表达:干预2天后,HG(1.05±0.03)和IG(1.12±0.03)分别与NG(0.97±0.05)和MG(0.97±0.05)相比,PKCβ2 mRNA表达明显升高(P=0.03,P=0.00;P=0.003,P=0.003),且IG高于HG(P=0.04);干预7天后,HG(1.11±0.02)和IG(1.21±0.01)较NG(0.95±0.07)和MG(0.96±0.05)均显著升高(P=0.00,P=0.008;P=0.004;P=0.003),且IG比HG升高明显(P=0.03);干预14天后,HG(1.18±0.03)和IG(1.28±0.04)分别与NG(0.97±0.07)和MG(0.95±0.03)相比,PKCβ2 mRNA表达明显升高(P=0.01,P=0.00;P=0.002,P=0.004),且IG比HG升高更加明显(P=0.02)。随着时间的延长,HG和IG组PKCβ2 mRNA的表达7天较2天明显升高(P=0.014,P=0.004),14天较7天显著升高(P=0.02,P=0.03)。8.PKCβ2蛋白水平的表达:干预2天后,HG(0.56±0.03)和IG(0.65±0.04)分别与NG(0.47±0.04)和MG(0.48±0.06)相比,PKCβ2在蛋白水平的表达明显升高(P=0.04,P=0.00;P=0.003,P=0.002),且IG高于HG(P=0.03);干预7天后,HG(0.74±0.03)和IG(0.83±0.02)较NG(0.49±0.03)和MG(0.48±0.07)显著升高(P=0.006,P=0.005;P=0.003,P=0.004),且IG高于HG(P=0.03);干预14天后,HG(0.85±0.03)和IG(1.01±0.05)分别与NG(0.48±0.06)和MG(0.48±0.04)相比,其蛋白水平明显升高(P=0.01,P=0.002;P=0.002,P=0.004),且IG比HG升高更加明显(P=0.03)。随着时间的延长,HG和IG组PKCβ2蛋白的表达7天较2天明显升高(P=0.03,P=0.02),14天较7天显著升高(P=0.04,P=0.03)。结论:1.恒定和波动高糖均可通过氧化应激损伤内皮,波动高糖的损伤作用更明显;并有时间依赖性,控制血糖不仅着眼于持续高糖,更重要的是控制波动高糖及早期干预。2.高糖对内皮细胞的损伤可能与PKCα和PKCβ2通路有关,高糖损伤内皮后可通过上调SelS表达保护内皮,但尚不足以抵御高糖诱导的氧化应激损伤。
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