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SCP-88抑制高糖诱导的大鼠系膜细胞表达细胞外基质蛋白

作　者: 赵智芳
导　师: 梁敏；聂静
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: 高糖细胞外基质纤维连接蛋白 Ⅳ型胶原蛋白激酶C NADPH氧化酶
分类号: R692.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景糖尿病肾病(diabetic nephrophthy, DN)是糖尿病(简称DM)的微血管并发症之一。在发达国家中它是导致终末期肾脏疾病(ESRD)的首要原因,全世界范围内,需要透析治疗的新病例中有35%-40%是由糖尿病肾病引起的。DN给病人、社会及医疗系统造成了巨大的负担。研究DN的发生机制,寻求防治DN的方法和手段成为科学领域的热点。DN病理改变的特征表现为肾小球肥大、肾小球系膜细胞增殖、系膜细胞外基质(ECM)增加和肾小球基底膜增厚,最终发展成为肾小球硬化,小球功能丧失。而ECM的过度积聚是DN的核心特点。由此可见,系膜细胞在DN的发生中是一个重要的靶细胞。已有大量体外实验证明,高糖、晚期糖基化终产物(AGE)、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)和晚期氧化蛋白产物(AOPP)等均能刺激系膜细胞ECM的积聚。血液中葡萄糖浓度超标是DM的主要临床特点。研究发现控制血糖可以延缓DN的发生。系膜区ECM积聚是DN的重要特点。用高糖刺激系膜细胞时发现细胞外基质蛋白的表达增加,降解细胞外基质蛋白的酶表达减少,细胞外基质合成和降解失衡,导致了ECM蛋白的过多表达。高糖激活的多条信号通路对糖尿病肾病的形成起着很重要的作用,尤其是ECM蛋白的产生机制研究倍受关注。葡萄糖主要通过系膜细胞上的葡萄糖转运体(GLUT-1)进入细胞内。研究发现高糖刺激系膜细胞能够使系膜细胞上GLUT-1表达上调,大量的葡萄糖进入系膜细胞内。过多的葡萄糖进入多元醇途径、DAG合成途径和己糖氨途径进行代谢。多元醇代谢途径增加时系膜细胞内山梨醇产生过多,导致了NADH/NAD+比例升高,DAG的从头合成增加,激活PKC。PKC是高糖对系膜细胞产生病理损伤的关键激酶,它在系膜细胞中对ECM蛋白的合成起重要作用。它隶属丝氨酸-苏氨酸激酶家族,经典的PKC包括a、β1、β2和丫亚型。PKC对血管通透性、血管收缩、细胞增殖和ECM合成具有调控作用。PKC可以活化转录因子c-fos和c-jun,两者复合成AP-1。AP-1这种核因子可以引起ECM蛋白的表达。研究发现使用PKC的抑制剂能够改善高糖刺激系膜细胞过多表达ECM蛋白(纤连蛋白和Ⅳ型胶原)。由此可见,PKC在高糖刺激系膜细胞的信号传导中起到关键的作用。高糖刺激系膜细胞会发生明显的氧化应激。活性氧(ROS)是超氧阴离子(02-)、过氧化氢(H202)、一氧化氮(NO)和羟自由基(OH")等活性含氧化合物的总称。肾小球ROS的产生与多种因素和途径有关,包括高糖、晚期糖基化终产物(AGE)、晚期氧化蛋白产物(AOPP)^血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、细胞因子(如TGF-β1)、NADPH氧化酶等。细胞内ROS的重要来源是胞膜区、线粒体及微粒体的酶,这些酶大多依赖于NADPH,肾小球系膜细胞中具有这种依赖于NADPH的氧化酶。研究发现高糖刺激大鼠肾小球系膜细胞可以通过PKC依赖的NADPH氧化酶的活化刺激ROS的生成。氧化应激是细胞应激的一个普遍现象,ROS可以作为损伤因子,也可以作为信号分子传递信号。研究发现ROS跟高糖刺激的系膜细胞过度表达ECM蛋白有密切关系。使用抗氧化剂(如维生素C)可以抑制ROS的产生和ECM蛋白的表达。近来的研究发现高糖刺激大鼠系膜细胞能够活化系膜细胞膜上的内皮生长因子受体(EGFR),激活下游的信号：PLC-yl和PI3K。PKC作为两者下游信号受到激活,使系膜细胞ECM蛋白分泌增加。SCP-88是中草药石菖蒲的单体提取物。本实验室的研究发现它能明显抑制高糖诱导系膜细胞产生氧自由基。根据氧化应激和ECM蛋白表达的密切关系,我们猜测SCP-88具有抑制ECM蛋白的作用。于是本实验以高糖刺激大鼠系膜细胞作为模型,针对ECM蛋白产生的信号通路,研究SCP-88对ECM蛋白的抑制作用及其作用机制。为糖尿病肾病的治疗寻找新的药物。研究方法一、大鼠系膜细胞的培养HBZY-1大鼠系膜细胞系复苏后在37℃、5%CO2条件下用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养细胞,待细胞生长至80%融合时用于实验。二、大鼠系膜细胞活力测定系膜细胞生长至融合,无血清培养基静置12小时,加入0、2、10、50μMSCP-88和2μl DMSO刺激系膜细胞12小时。用MTT方法检测细胞活力。三、大鼠系膜细胞纤维连接蛋白和IV型胶原mRNA水平的测定系膜细胞生长至融合,无血清培养基静置12小时,分为正常糖组和高糖组。正常糖组分别以0、10μM SCP-88,高糖组分别以0、0.1、1、10、50μM SCP-88和200u/ml SOD预孵育一小时后,正常糖组以5.6mM,高糖组以30mM右旋葡萄糖刺激12小时。提取细胞RNA用Real-Time PCR方法检测纤维连接蛋白和ⅥV型胶原的mRNA水平。四、大鼠系膜细胞纤维连接蛋白和ⅥV型胶原蛋白表达的测定系膜细胞生长至融合,无血清培养基静置12小时,分为正常糖组和高糖组。正常糖组分别以0、10μM SCP-88,高糖组分别以0、0.1、1、10、50μM SCP-88和200u/ml SOD预孵育一小时后,正常糖组以5.6mM,高糖组以30mM右旋葡萄糖刺激12小时。提取细胞总蛋白用Western Blotting方法检测纤维连接蛋白和Ⅵ型胶原的表达。五、大鼠系膜细胞p47phox磷酸化水平的测定系膜细胞生长至融合,无血清静置12小时,分为正常糖组和高糖组。正常糖组分别加入0、10μM SCP-88,高糖糖组分别加入0、SCP-88预孵育一小时后,正常糖组加入5.6mM右旋葡萄糖,高糖组加入30mM右旋葡萄糖刺激细胞30分钟。提取细胞总蛋白,用免疫沉淀和Western Blotting方法检测p47phox磷酸化和总蛋白的表达。六、p22phox-p47phox结合的测定系膜细胞生长至融合,无血清静置12小时,分为正常糖组和高糖组。正常糖组分别加入0、10μM SCP-88,高糖组分别加入0、10μM SCP-88预孵育一小时后,正常糖组加入5.6mM右旋葡萄糖,高糖组加入30rmM右旋葡萄糖刺激细胞30分钟。提取细胞总蛋白,用免疫沉淀Western Blottin方法检测p22phox-p47phox结合和p22phox蛋白的表达。七、p22phox和p47phox蛋白表达的测定系膜细胞生长至融合,无血清静置12小时,分为正常糖组和高糖组。正常糖组分别加入0、10μM SCP-88,高糖组分别加入0、10μM SCP-88预孵育一小时后,正常糖组加入5.6mM右旋葡萄糖,高糖组加入30mM右旋葡萄糖刺激细胞12小时。提取细胞总蛋白,用Western Blotting方法检测p22phox和p47phox蛋白的表达。八、大鼠系膜细胞PKC磷酸化水平的测定系膜细胞生长至融合,无血清静置12小时,分为正常糖组和高糖组。正常糖组分别加入0、10μM SCP-88,高糖组分别加入0、10μM SCP-88预孵育一小时后,正常糖组加入5.6rmM右旋葡萄糖,高糖组加入30rmM右旋葡萄糖刺激细胞15分钟。提取细胞总蛋白,用Western Blotting方法检测PKCa和PKCβ1磷酸化蛋白和总蛋白的表达。九、大鼠系膜细胞PLC-γ1和PI3K-p85磷酸化水平的测定系膜细胞生长至融合,无血清静置12小时,分为正常糖组和高糖组。正常糖组分别加入0、10μM SCP-88,高糖组分别加入0、10μM SCP-88预孵育一小时后,正常糖组加入5.6mM右旋葡萄糖,高糖组加入30mM右旋葡萄糖刺激细胞15分钟。提取细胞总蛋白,用Western Blotting方法检测PLC-γ1和PI3K-p85磷酸化蛋白和总蛋白的表达。结果一、SCP-88对大鼠系膜细胞活力的影响MTT实验显示SCP-88刺激大鼠系膜细胞12小时后对其活力无影响,2、10、50μM的SCP-88刺激组与DMSO组细胞活力比较无明显差异(P>0.05)。二、SCP-88对纤维连接蛋白的影响1.SCP-88抑制高糖诱导系膜细胞的纤维连接蛋白mRNAReal-Time PCR结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞12小时后,纤维连接蛋白mRNA水平显著增高(P<0.05)。SCP-8可以显著抑制高糖诱导的纤维连接蛋白(P<0.05)。而10μM SCP-88对正常糖组纤维连接蛋白mRNA的表达无明显影响(P>0.05)2.SCP-88抑制高糖诱导系膜细胞表达纤维连接蛋白Western Blotting结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞12小时后,纤维连接蛋白表达显著增高(P<0.05). SCP88可以显著抑制高糖诱导的纤维连接蛋白表达(P<0.05)。而10μM SCP-88对正常糖组纤维连接蛋白的表达无明显影响(P>0.05)。三、SCP-88对Ⅳ型胶原的影响1.SCP-88抑制高糖诱导系膜细胞Ⅵ型胶原mRNAReal-Time PCR结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞12小时后,Ⅳ型胶原mRNA水平显著增高(P<0.05)。SCP-88可以显著抑制高糖诱导的Ⅳ型胶原mRNA的表达(P<0.05)。而10μM SCP-88对正常糖组Ⅵ型胶原mRNA的表达无明显影响(P>0.05)。2.SCP-88抑制高糖诱导系膜细胞表达四型胶原Western Blotting结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞12小时后,Ⅵ型胶原表达显著增高(P<0.05)。SCP-88可以显著抑制高糖诱导的Ⅵ型胶原表达(P<0.05)。而10μM SCP-88对正常糖组Ⅵ型胶原的表达无明显影响(P>0.05)。四、SCP-88对NADPH氧化酶的影响1.SCP-88对高糖刺激系膜细胞p47phox磷酸化的影响免疫沉淀和Western Blotting结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞30分钟后,p47phox磷酸化蛋白表达显著增加(P<0.05)。SCP-88能够抑制高糖诱导的p47phox磷酸化蛋白表达(P<0.05)。而SCP-88对正常糖诱导p47phox磷酸化蛋白的表达无影响(P>0.05)。2.SCP-88对高糖刺激系膜细胞p47phox和p22phox结合的影响。免疫沉淀和Western Blotting结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞30分钟后,与p22phox结合的p47phox显著增加(P<0.05)。SCP-88能够抑制高糖诱导的p47phox和p22phox的结合(P<0.05)。而SCP-88对正常糖组p47phox和p22phox的结合无明显影响(P>0.05)。3.SCP-88对高糖刺激系膜细胞p47phox和p22phox蛋白表达的影响Western Blotting结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞12小时后,p47phox和p22phox的表达明显增加(P<0.05)。SCP-88能够抑制高糖诱导的p47phox和p22phox的表达(P<0.05)。而SCP-88对正常糖组p47phox和p22phox的表达无明显影响(P->0.05)。五、SCP-88对高糖刺激系膜细胞PKC磷酸化的影响Western Blotting结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞15分钟后,PKCα和PKCβ1磷酸化明显增加(P<0.05)。SCP-88能够抑制高糖诱导的PKCα和PKCβ1的磷酸化(P<0.05)。而SCP-88对正常糖组PKCα和PKCβ1磷酸化无明显影响(P>0.05)。六、SCP-88对高糖刺激系膜细胞PLCγ1和p85磷酸化的影响Western Blotting结果显示高糖刺激大鼠系膜细胞15分钟后,PLCγ1和p85磷酸化明显增加(P<0.05)。SCP-88能够抑制高糖诱导的PLCγ1和p85的磷酸化(P<0.05)。而SCP-88对正常糖组PLCγ1和p85磷酸化无明显影响(P>0.05)。结论SCP-88能够抑制高糖诱导大鼠系膜细胞ECM蛋白的表达。它通过抑制PLCγ1、p85、PKC (PKCa和PKCβ1)、NADPH氧化酶的活化发挥对ECM蛋白表达的抑制作用。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-20
前言  20-23
材料和方法  23-41
  1.1 主要仪器设备  23-24
  1.2 主要试剂与配制  24-28
  1.3 大鼠系膜细胞的培养  28
  1.4 大鼠系膜细胞活力测定  28-29
  1.5 Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白mRNA的检测  29-31
  1.6 纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达的检测  31-33
  1.7 SCP-88对NADPH氧化酶的影响  33-37
  1.8 PKC磷酸化蛋白表达的检测  37-38
  1.9 PLC-γ1和PI3K-p85磷酸化蛋白表达的检测  38-40
  2.0 统计学处理  40-41
结果  41-54
  一、SCP-88对大鼠系膜细胞活力的影响  41
  二、SCP-88对纤维连接蛋白的影响  41-43
  三、SCP-88对Ⅳ型胶原的影响  43-46
  四、SCP-88对NADPH氧化酶的影响  46-49
  五、SCP-88对PKC磷酸化的影响  49-51
  六、SCP-88 PLCγ1和p85磷酸化的影响  51-54
讨论  54-58
参考文献  58-62
缩略词汇表  62-63
致谢  63-65
统计合格证明  65

SCP-88抑制高糖诱导的大鼠系膜细胞表达细胞外基质蛋白

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