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猪链球菌2型分离鉴定及其对免疫抑制小鼠的致病力比较

作　者: 吴迪
导　师: 方维焕
学　校: 浙江大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型分离鉴定免疫抑制小鼠致病性
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 14次
引　用: 2次
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内容摘要

猪链球菌是一种能引起猪发生脑膜炎、心内膜炎和关节炎等疾病的病原菌。猪链球菌2型(SS2)引起的疾病不但给养猪业造成严重经济损失,也给公共卫生和食品安全带来了威胁,已成为全球关注的人兽共患病。了解浙江地区临床健康猪和病猪中猪链球菌2型的携带情况、主要毒力基因分布、构建2型猪链球菌资源库以及建立预警体系,对该病的防制和保障相关从业人员的健康等方面具有重要意义。到目前为止,还没有一个针对SS2的理想动物模型,对SS2致病机理方面的研究尚不够深入,不同毒力菌株的感染力和感染持续时间不是十分清楚,影响了对该菌致病机制的研究。因此,建立一种能模拟自然感染发病动物临床症状和病理变化的动物模型,以深入研究其感染的体内动态分布、感染机制,该模型的建立对SS2的研究具有十分重要意义。(1)应用三重PCR方法,对浙江地区临床健康待宰猪和病猪中猪链球菌带菌的情况进行监测与分析,明确了二者猪链球菌的携带情况,对SS2主要毒力基因mrp、ef和sly分布进行进行序列分析。临床健康猪和病猪中SS及SS2分离率相近,前者SS分离率为8.85%,SS2分离率为0.44%；后者SS分离率为8.85%,SS2分离率为0.64%；所有的SS2菌株都含有mrp,而部分菌株则缺失ef和sly；与资阳SS2分离株05ZYH33相比,实验室部分分离株的mrp、ef和sly基因的核苷酸和氨基酸序列同源性与其都很高(>99%)。(2)猪链球菌2型免疫抑制BALB／C小鼠动物感染模型的建立和体内的分布。本实验选用免疫抑制BALB／C小鼠为实验动物,该小鼠具有体型小、方便饲养、成本低和易于管理等优点。实验采用猪链球菌2型分离株JX1105和JX0301为攻毒菌株,通过腹腔感染免疫抑制BALB／C小鼠,建立猪链球菌2型感染免疫抑制BALB／C小鼠的动物模型。结果显示：猪链球菌2型可人工感染免疫抑制BALB／C小鼠,症状明显,其临床症状和病理变化等表现与猪自然状态发病相似,模型重复性好。分别于攻毒后第6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h剖检观察其病理变化规律,利用细菌分离及PCR方法检测SS2在体内各组织中的分布情况和变化规律。实验发现SS2侵入血液的速度很快；进入肝脏、肺脏、肾脏等实质器官要稍慢；进入脑的时间最慢,说明细菌可能只有突破血脑屏障才能进入大脑。(3)不同毒力SS2菌株的感染力和感染持续时间。按照建立模型的攻毒方法和分组,攻毒后分别于6h、12h、24h、48h直到第168h观察临床症状,并无菌采血和分离肝脏,利用细菌平板计数和荧光定量PCR方法来检测血液中SS2的变化规律,用平板计数法检测小鼠肝脏中细菌变化规律。实验发现SS2进入血液和肝脏的速度很快,攻毒后6h左右即可在血液中检测到SS2,并在攻毒后24h或48h浓度达到高峰,随后开始减少,攻毒后120h血液中的SS2的数量快速减少甚至消失。本实验建立的荧光定量PCR方法灵敏、准确,可有效排除杂菌的影响。

全文目录

致谢  5-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
第一部分文献综述  13-29
  第一章猪链球菌的生物学特性及其流行病学研究进展  14-17
    1 生物学特性  14-15
    2 流行病学  15-17
      2.1 传染源  15
      2.2 易感动物  15-16
      2.3 传播途径  16
      2.4 人感染猪链球菌的情况  16-17
  第二章猪链球菌2型主要毒力因子  17-21
    1 溶菌酶释放蛋白(mrp)  17-18
    2 荚膜多糖(cps)  18
    3 溶血素(sly)  18-19
    4 胞外因子(ef)  19-20
    5 其它毒力因子  20-21
  第三章猪链球菌2型动物模型研究进展  21-23
    1 猪模型  21-22
    2 小鼠模型  22
    3 其它动物模型  22-23
  参考文献  23-29
第二部分试验研究  29-59
  第一章猪链球菌2型分离鉴定及序列分析  30-41
    1 材料与方法  31-35
      1.1 参考菌株、培养基与试剂  31
      1.2 采样时间  31
      1.3 采样方法  31
      1.4 猪链球菌的分离鉴定  31-32
      1.5 部分菌株的mrp、ef和sly全基因的PCR扩增和序列分析  32-35
    2 结果  35-38
      2.1 不同来源的样品中SS及SS2分离情况  35-36
      2.2 猪链球菌三重PCR鉴定  36
      2.3 sly、mrp和ef的在不同菌株间的分布  36-38
      2.4 sly、mrp和ef基因序列分析  38
    3 讨论  38-39
    参考文献  39-41
  第二章猪链球菌2型免疫抑制小鼠感染模型的建立  41-50
    1 材料  41-42
      1.1 菌株  41
      1.2 实验动物  41
      1.3 主要培养基、试剂和仪器  41-42
    2 方法  42-45
      2.1 菌液的制备  42
      2.2 预实验  42-44
      2.3 SS2感染免疫抑制BALB/C小鼠模型的建立  44-45
    3 结果  45-47
      3.1 临床症状和病理变化  45-46
      3.2 各脏器细菌分离鉴定  46-47
    4 讨论  47-49
      4.1 免疫抑制小鼠模型的建立  48
      4.2 SS2在体内的动态分布  48-49
    参考文献  49-50
  第三章免疫抑制对不同毒力SS2菌株感染力和感染持续时间的影响  50-59
    1 材料  50-51
      1.1 细菌  50
      1.2 实验动物  50
      1.3 主要试剂  50
      1.4 主要仪器和设备  50-51
    2 方法  51-52
      2.1 样品的采集和处理  51
      2.2 血液和肝脏中SS2细菌平板计数  51-52
      2.3 荧光定量PCR方法的建立和标准曲线的绘制  52
    3 结果  52-57
      3.1 临床症状的观察  52-53
      3.2 血液中SS2细菌计数结果  53-54
      3.3 荧光定量PCR标准曲线的绘制  54-55
      3.4 融解曲线分析  55
      3.5 荧光定量PCR检测血液中SS2的含量  55-57
    4 讨论  57-58
      4.1 荧光定量PCR方法的建立  57-58
      4.2 免疫抑制对不同毒力SS2菌株感染力和感染持续时间的影响  58
    参考文献  58-59
附录常用缓冲液及培养基配方  59-64
作者简介  64

猪链球菌2型分离鉴定及其对免疫抑制小鼠的致病力比较

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