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水稻细菌性条斑病菌中受DSF调控的鞭毛基因和天冬酰胺合成酶基因的功能分析

作　者: 殷芳群
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻细菌性条斑病菌 鞭毛基因 asnB基因 DSF 致病性
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


水稻黄单胞菌包含两个致病变种Xanthomonas orzae pv.oryzae(Xoo)和X.opvzae pv.oryzicola肠(Xoc),在水稻上分别引起白叶枯病和细菌性条斑病。为了阐明可扩散性信号分子(diffusible signal factor,DSF)调控的两个鞭毛基因flgD和flgE以及天冬酰胺合成酶基因(asparagine synthetase B,asnB)对水稻细菌性条斑病菌Rs105在致病性等方面的影响。在本研究中,我们克隆了flgD、flgE和asnB基因,并对其进行序列分析。用同源重组的方法构建相应基因的缺失突变株,明确了这三个基因对水稻细菌性条斑病菌在运动性,致病性和生长能力等方面的影响,以此来推知基因的功能；并进一步证明了DSF通过调控flgD、flgE和asnB基因得表达,从而影响条斑病菌的致病性等表型。为深入认识DSF对细菌性条斑病菌相关基因的调控提供了科学依据。(一)采用PCR的方法从Rs105基因组中克隆到flgD和flgE基因,并证实这两个基因在基因组中均为单拷贝。用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病性及过敏性反应等表型,用反转录PCR(RT-PCR)的方法验证Rs105和ΔrpF(rpfF基因的缺失突变体,不产生DSF)中flgD、flgE表达量的差异。PCR和Southern杂交结果显示,flgD、flgE基因被成功敲除。与野生型相比,突变体的鞭毛产生能力丧失,游动性和趋化性能力减弱,接种水稻叶片显示其致病性部分减弱,基因互补可使其恢复。生长能力和对烟草叶片的致敏性无明显改变。RT-PCR结果显示,flgD、flgE基因在ΔrpfF中的转录水平明显降低。这表明：FlgD、FlgE是水稻细菌性条斑病菌鞭毛形成所必需的因子；进一步证明了DSF通过调控flgD、flgE基因表达,从而影响条斑病菌的致病性等表型。(二)从Rs105基因组中克隆到asnB基因,并证实这个基因在基因组中为单拷贝。用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病性和过敏性反应、在水稻叶片中的繁殖能力以及在添加不同氮源的MMX基本培养基里的生长能力等表型,用反转录PCR(RT-PCR)的方法验证Rs105和ΔrpfF(rpfF基因的缺失突变体,不产生DSF)中asnB表达量的差异。PCR和Southern杂交结果显示,asnB基因被成功敲除。与野生型相比,突变体接种水稻叶片显示其致病性基本丧失,基因互补可使其恢复。asnB基因的缺失严重影响了细菌性条斑病菌的生长,添加外源天冬酰胺可使其生长情况恢复。鞭毛产生能力,游动性和趋化性能力,降解胞外蛋白酶、纤维素酶的能力以及对烟草叶片的致敏性等无明显改变。RT-PCR结果显示,asnB基因在ΔrpfF中的转录水平明显降低。试验表明：asnB基因是细菌性条斑病菌正常生长所必需的,其突变可使细菌丧失致病性；进一步证明了DSF通过调控asnB基因表达,从而影响条斑病菌的致病性等表型。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12第一部分 文献综述  12-36  第一章 水稻细菌性条斑病菌的毒性和致病机理研究  12-24    1 稻黄单胞菌稻生致病变种和水稻细菌性条斑病概述  12-14    2 水稻细菌性条斑病菌的分类与分化  14-15    3 水稻细菌性条斑病菌的毒性和致病机理  15-24      3.1 胞外水解酶类  16-17      3.2 胞外多糖和脂多糖  17-19      3.3 依赖dsp基因的效应分子  19-20      3.4 hrp基因  20-21      3.5 毒素  21-22      3.6 生长调节物质  22-24  第二章 群体感应系统及其毒性调控  24-32    1 群体感应系统的发现  24-25    2 不同类型的QS信号分子  25-27    3 DSF型QS信号传导通路  27-30      3.1 RpfC和RpfG构成双组分系统感应和转换DSF信号  28      3.2 第二信使cyclic-di-GMP的调节DSF信号传导  28-29      3.3 全局性转录调节因子Clp与DSF信号传导有关  29-30    4 群体感应系统的应用  30-32      4.1 细菌群感效应的淬灭  30      4.2 细菌群体感应的应用研究进展  30-32  第三章 细菌鞭毛的研究进展  32-36    1 细菌鞭毛的结构  32-33    2 细菌鞭毛的合成  33-34    3 细菌鞭毛的运动机理  34    4 细菌鞭毛的功能  34-36第二部分 研究内容  36-82  第一章 水稻细菌性条斑病菌中受DSF调控的鞭毛基因flgD、flgE的功能分析  36-64    1 材料与方法  37-51      1.1 供试菌株、质粒和引物  37-38      1.2 培养基及抗生素  38-40      1.3 细菌基因组DNA的提取  40-41      1.4 质粒的提取  41-42      1.5 DNA酶切、连接和PCR产物回收  42      1.6 质粒的转化  42-44      1.7 Southern杂交  44-47      1.8 缺失突变体的构建  47-48      1.9 互补菌株的构建  48      1.10 细胞形态和鞭毛观察  48      1.11 游动性和趋化性试验  48      1.12 细菌沉降性试验  48-49      1.13 胞外蛋白酶的检测  49      1.14 胞外多糖的检测  49      1.15 生物膜的检测  49      1.16 过敏性反应和致病性的测定  49-50      1.17 总RNA的提取及RT-PCR扩增  50-51      1.18 序列分析  51    2 结果与分析  51-62      2.1 flgD和flgE基因的克隆  51-52      2.2 flgD和flgE突变株的构建  52-54      2.3 互补菌株的构建  54-55      2.4 flgD和flgE基因突变影响Xoc鞭毛合成和运动性  55-56      2.5 flgD和flgE基因的突变不影响Xoc正常生长  56-57      2.6 flgD和flgE基因突变后产生沉降现象  57-58      2.7 flgD和flgE基因突变后不影响胞外蛋白酶的产生  58      2.8 flgD和flgE基因突变后不影响胞外多糖的产生  58-59      2.9 flgD和flgE基因与生物膜的形成无关  59-60      2.10 flgD和dgE基因突变影响Xoc致病性,但不影响过敏性反应  60-61      2.11 RT-PCR检测结果  61-62    3 讨论与结论  62-64      3.1 flgD和flgE基因与水稻细菌性条斑病菌鞭毛合成相关  62-63      3.2 flgD和flgE基因与水稻细菌性条斑病菌致病性相关,但不影响过敏性反应  63      3.3 flgD和flgE基因受DSF调控  63-64  第二章 水稻细菌性条斑病菌中受DSF调控的基因asnB的功能分析  64-82    1 材料与方法  65-68      1.1 供试菌株、质粒和引物  65      1.2 培养基及抗生素  65      1.3 细菌基因组DNA的提取  65      1.4 质粒的提取  65-66      1.5 DNA酶切、连接和PCR产物回收  66      1.6 质粒的转化  66      1.7 Southern杂交  66      1.8 缺失突变体的构建  66      1.9 互补菌株的构建  66      1.10 细胞形态和鞭毛观察  66-67      1.11 游动性和趋化性试验  67      1.12 细菌沉降性试验  67      1.13 胞外蛋白酶的检测  67      1.14 胞外多糖(EPS)的检测  67      1.15 生物膜的检测  67      1.16 过敏性反应和致病性的测定  67      1.17 细菌在水稻叶片内的繁殖能力测定  67      1.18 氮源利用检测  67-68      1.19 总RNA的提取及RT-PCR扩增  68      1.20 序列分析  68    2 结果与分析  68-79      2.1 asnB基因的克隆  68-69      2.2 asnB基因突变株的构建  69-71      2.3 互补菌株的构建  71-72      2.4 asnB基因突变不影响Xoc鞭毛合成和运动性  72-73      2.5 asnB基因突变后不产生沉降现象  73      2.6 asnB基因突变后不影响胞外蛋白酶的产生  73-74      2.7 asnB基因突变后不影响胞外多糖的产生  74-75      2.8 asnB基因与生物膜的形成无关  75      2.9 asnB基因突变影响Xoc致病性,但不影响过敏性反应  75-76      2.10 asnB基因的突变影响细菌在水稻叶片内的繁殖能力  76-77      2.11 asnB基因的突变影响Xoc对不同氮源的利用  77-79      2.12 RT-PCR检测结果  79    3 讨论与结论  79-82      3.1 asnB基因与水稻细菌性条斑病菌致病性相关,但不影响过敏性反应  80      3.2 asnB基因影响水稻细菌性条斑病菌的生长能力  80      3.3 asnB基因受DSF调控  80-82附录  82-84参考文献  84-92致谢  92

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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