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副猪嗜血杆菌，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌2型三重PCR方法的建立与应用

作　者: 张仁良
导　师: 何孔旺；姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 三重PCR 副猪嗜血杆菌 猪传染性胸膜肺炎 猪链球菌2型
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)病,猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia, PCP)和猪链球菌(Swine streptococosis, SS)病是当前严重困扰我国生猪养殖业的三种常见传染性细菌疾病。其病原体分别是副猪嗜血杆菌,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌。三种病原菌均有多个血清型,均能引起一系列呼吸道症状。其中,HPS是猪上呼吸道正常定居菌,链球菌2型是一种人兽共患传染病病原菌。三种病原菌均主要侵害幼龄仔猪和保育猪,可以引起较高的发生率和死亡率,且在临床上鉴别难度较大,给全球生猪养殖造成了巨大的经济损失。本研究建立了基于传染性胸膜肺炎放线杆菌的APXⅣA毒素基因,副猪嗜血杆菌16S rRNA和猪链球菌2型CPS 2J基因序列的三重PCR检测方法,经实验检测,具有很好的重复性,特异性和敏感性,并应用此方法对一些临床样品成功进行了检查。首先,是副猪嗜血杆菌,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌三重PCR方法的建立：针对传染性胸膜肺炎的APXⅣA毒素基因,猪链球菌2型CPS 2J基因和副猪嗜血杆菌16S rRNA序列各设计1对特异性引物,分别能扩增出242bp,822 bp和500 bp的DNA片段。将三对引物置于25微升体系进行优化,经过对阳性模板的扩增,找出最优反应体系,并经酶切鉴定,确定目的片段得到了正确扩增。重复性,特异性实验表明：该实验具有很好的重复性,对多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等具有特异性。敏感性实验表明：最低可检测到的细菌含量为：HPS 620cfu; SS 890cfu; APP 1260cfu。;最低可以检测到的细菌核酸量为：HPS 2.41ng/ml; SS 930pg/ml;APP 1.48ng/ml其次,对采集的50份病料进行常规的细菌分离鉴定后,用本研究所建立的三重PCR及单PCR进行检查,结果表明,该三重PCR方法灵敏度与常规单PCR完全吻合,比常规细菌分离鉴定方法准确。证明本实验建立的副猪嗜血杆菌,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌三重PCR方法在检测上述三种疾病方面具有应用价值。另外,用本方法检测了采自江苏和安徽的其他230份病料。检测结果表明,当前,副猪嗜血杆菌发病率在呼吸道疾病的发病率中所占比例较高(30.9%),而胸膜肺炎放线杆菌所占比例较低(仅占2.2%),且二重感染比较明显(占7.8%)。用本方法对300份屠宰场外观健康猪的肺脏进行的检测结果表明,当前猪场中存在一定程度的副猪嗜血杆菌威胁(带菌率为13.7%)。

全文目录


中文摘要  6-8ABSTRACT  8-10第一篇 文献综述  10-56  1 副猪嗜血杆菌研究进展  10-19    1.1 细菌形态及培养特性  10-11    1.2 流行病学  11    1.3 临床症状及病理变化  11-12    1.4 细菌分型  12-13    1.5 致病因子的研究  13-15    1.6 发病机理  15-16    1.7 HPS诊断方法  16    1.8 HPS治疗及耐药性研究  16-17    1.9 hps疫苗  17-19  2 传染性胸膜肺炎研究进展  19-32    2.1 细菌形态及培养特性  19-20    2.2 流行病学  20-21    2.3 临床症状及病理变化  21-22    2.4 细菌分型  22    2.5 毒力因子  22-25    2.6 APP的致病机理  25    2.7 疫苗研究  25-30    2.8 app诊断方法  30-31    2.9 APP治疗及耐药性研究  31-32  3 猪链球菌研究进展  32-44    3.1 病原学  32-33    3.2 流行病学  33-34    3.3 临床症状及病理变化  34    3.4 毒力因子  34-37    3.5 猪链球菌疫苗研究现状  37-40    3.6 致病机理  40    3.7 诊断方法  40-42    3.8 治疗及耐药性研究  42-44  参考文献  44-56第二篇 试验部分  56-84  1 材料与方法  57-62    1.1 菌种  57    1.2 主要仪器及试剂  57    1.3 常用缓冲液  57    1.4 实验动物  57    1.5 细菌培养及模板提取  57-59    1.6 引物设计与合成  59-60    1.7 实验设计  60-62    1.8 三重PCR应用  62  2 实验内容  62-80    2.1 单一体系PCR扩增条件的确定  62-69    2.2 三重PCR扩增条件的优化  69-76    2.3 三重PCR应用  76-80  4 全文总结  80-82  参考文献  82-84附录:本实验所用试剂配制  84-86致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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