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芝麻枯萎病病原菌分离、鉴定及种质抗枯萎病特性研究

作　者: 苏银玲
导　师: 张海洋
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 芝麻枯萎病病原菌分离鉴定抗枯萎病特性 EST
分类号: S435.653
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

芝麻(Sesamum indicum L.,2n=26),隶属于胡麻科胡麻属,是世界上最古老的油料作物之一。芝麻枯萎病常年发病率15%左右,严重时可达30%以上,对我国芝麻产量和品质影响较大。芝麻枯萎病是由尖孢镰刀菌芝麻专化型(Fusarium oxysporum f. sp. sesame)侵染引起,芝麻在其全生育期均可被侵染。与瓜类、茄科类农作物枯萎病研究进展相比,芝麻枯萎病病原菌分离和鉴定技术、病原菌侵染和致病机理、芝麻抗枯萎病机理及抗病育种研究等方面均表现滞后。本文在2009～2010年分别在河南、河北、山西、湖北、江西、江苏、安徽、辽宁、吉林、黑龙江共10个省收集了421株芝麻枯萎病病株,从中成功分离到450株病原菌。对其中133株镰刀菌的菌落颜色、菌落状态、4d菌落的生长速度、10d的产孢量、大小孢子的形状、大小孢子的长宽、产孢细胞类型、小孢子着生方式、厚垣孢子着生方式、粘孢团有无等12个性状进行了调查。通过形态学鉴定,初步确定85株尖孢镰刀菌,21株茄病镰刀菌,15株潮湿镰刀菌,分别占分离获得菌株数的63.9%,15.8%和10.7%。尖孢镰刀菌为芝麻枯萎病的优势菌。从病菌地理来源来看,尖孢镰刀菌和潮湿镰刀菌主要分离自河南省芝麻枯萎病病株,茄病镰刀菌有一半分离自河南省病株。采用菌落状态、大孢子形状、小孢子形状、产孢细胞类型、小孢子着生方式、厚垣孢子着生方式、粘孢团的有无等7个性状对数值分类进行聚类分析。对于133株供试菌株,在77%的相似水平上能够聚在一起；在相似度为80%时,根据小孢子着生方式分为类群Ⅰ和Ⅱ；在相似度为82%时,依据产孢细胞的长度可将Ⅱ类群分为A和B两个类群；在相似度为84.6%时,根据产孢细胞类型可将B类群分为1和2两个类群；在相似度为85.7%时2类群可依据菌落状态分为a和b两个类群。通过分析比较认为,数值分类与形态鉴定一致性较好,两者分析吻合度达到96%。利用ITS(Internal Transcribed Spacer,内转录间隔区)、EF-1a(Translation Elongation Factor la,转录延伸因子)和SSU (Small Subunit rDNA,核糖体小亚基rDNA)3个基因保守序列对其中128份菌株进行序列扩增并测序,根据序列聚类结果可以看出,镰刀属的李瑟组、茄病镰刀菌与尖孢镰刀菌在ITS和EF-1a两个基因上有特异性,但潮湿镰刀菌与尖孢镰刀菌因在这两个基因上的进化速率太慢无法区分；而SSU序列在镰刀属种下则表现为过于保守,仅根据SSU序列尚无法区分茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、潮湿镰刀菌与李瑟组菌株的差异。分子鉴定与生物学性状鉴定结果比较分析,由于生物学性状涉及指标较完整,因此镰刀菌属的种类鉴定以生物学性状鉴定为主,结合分子鉴定。利用室内种子及幼苗开展病原菌致病性鉴定技术研究,初步确定病原菌室内致病性鉴定技术体系。对133份病原菌进行种子接菌,种子萌发前接菌致病性鉴定得到强致病性菌株63个；对133份病原菌进行幼苗接菌,室内出苗6d后接菌致病性鉴定得到强致病性菌株33个。2010年选用室内致病性鉴定得到的强致病性菌株7F3、8F30、9F67共3个菌株建立大田人工混合病圃,建立人工病圃芝麻枯萎病抗性鉴定技术体系。以豫芝11为对照,通过对169份芝麻资源及品种进行枯萎病抗性鉴定,确定高抗品种16个,抗病品种31个,感病品种99个,高感品种5个；以所有品种平均抗性指数为对照得到高抗品种31个,抗病品种44个,感病品种75个,高感品种2个。为探明芝麻对枯萎病病原菌抗感病的分子机理,本文选用强致病性菌株对芝麻(抗病品种豫芝11,感病品种四川荣县黑芝麻)幼苗(第二对真叶完全展开时)进行接菌处理,分别取处理0,6,12,24小时后的植株。提取RNA后进行EST测序,通过生物信息处理和比较,抗病芝麻材料较感病材料表达量上调10倍以上的基因共有633条,下调10倍以上的基因有61条；基因表达差异性较大的Unigene基因共有694个。目前对抗病候选基因研究仍在进行中。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-10缩写与缩略词 10-11第一章前言 11-25 1 芝麻枯萎病的发生与特征 11-12 2 镰刀菌的分类与鉴定 12-22 2.1 镰刀菌属不同种的分类 12 2.2 镰刀菌属形态学分类 12-17 2.3 生物学种的研究 17 2.4 系统发育学种的研究 17-22 3 镰刀菌的致病性研究 22-23 4 芝麻抗枯萎病研究进展 23-25本研究的目的和意义 25-27第二章芝麻枯萎病菌分离及形态鉴定 27-49 1 材料与方法 27-33 1.1 感病植株采集及处理 27 1.2 培养基配制 27 1.3 病原菌的分离 27-28 1.4 病原菌单孢分离纯化 28 1.5 病原菌的保存 28 1.6 病原菌形态学观察指标 28-29 1.7 数值分类标准 29-33 2 结果与分析 33-46 2.1 形态学鉴定结果与分析 33-43 2.2 数值分类结果与分析 43-46 3 讨论 46-49第三章病原菌的分子鉴定 49-65 1 材料与方法 49-54 1.1 供试菌株 49-51 1.2 DNA的提取 51 1.3 PCR扩增 51-53 1.4 PCR扩增产物测序 53 1.5 测序结果的处理及BLAST分析 53 1.6 系统树的建立 53-54 2 结果与分析 54-63 2.1 PCR结果 54 2.2 测序结果系统进化分析 54-63 3 讨论 63-65第四章病原菌致病性鉴定 65-69 1 材料与方法 65-66 1.1 致病性鉴定供试材料 65 1.2 研究方法 65-66 2 结果与分析 66-67 2.1 种子萌发前接菌鉴定结果 66-67 2.2 出苗后接菌鉴定结果 67 3 讨论 67-69第五章芝麻枯萎病抗性鉴定 69-75 1 材料与方法 69-70 1.1 抗性鉴定供试材料 69 1.2 田间鉴定方法 69 1.3 田间病情调查分级及抗性类型划分标准 69-70 2 结果与分析 70-73 3 讨论 73-75第六章芝麻枯萎病抗性机理初探 75-79 1 材料与方法 75-77 1.1 材料 75 1.2 方法 75-77 2 结果 77 3 讨论 77-79全文结论 79-81参考文献 81-89附录一 89-90附录二 90-103致谢 103

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