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水稻黄单胞菌clp基因的克隆及功能研究

作　者: 韩志成
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻黄单胞菌 clp基因 致病性 游动性 鞭毛功能 趋化性 胞外多糖 毒力
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


水稻黄单胞菌包含两个致病变种Xanthomonas orzae pv. oryzae (Xoo)和X. oryzae pv. oryzicola (Xooc),在水稻上分别引起白叶枯病和细菌性条斑病。在本研究中,我们鉴定了水稻白叶枯病菌PX099菌株和水稻条斑病菌Rs105菌株clp基因的部分功能,明确了clp基因对这两种植物病原菌在致病性,游动性,趋化性,胞外多糖和毒力方面的影响。(一)根据水稻黄单胞菌clp基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻条斑病菌中克隆了clp同源基因,命名为clp。通过缺失突变构建了Rs105的clp基因突变体,经PCR验证确认。与野生型菌株Rs105相比,clp基因突变体并不影响正常生长,并且仍可激发非寄主烟草的过敏性反应。有趣的是,clp基因突变体鞭毛没有缺失,但是却极大减弱了游动性,并基本丧失致病性。此外,在有氧条件下,该突变体对葡萄糖几乎不产生趋化性应答。明显地,与野生型菌株相比,clp突变体减少了胞外多糖的分泌量,并且显著削弱了在成株期水稻上的毒力。结果显示,水稻条斑病菌的clp基因对其在水稻上的致病力起重要作用。(二)根据黄单胞菌clp基因的序列设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)中克隆了clp基因,命名为clpxoo。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。通过缺失突变的方法,构建了clp的缺失突变体。对游动性及葡萄糖的趋化应答能力检测发现,clp基因突变株的游动性和趋化能力明显降低,且在试管沉降实验中差异显著,但是在电镜下观察发现clp突变株的鞭毛和野生菌差异不大。胞外多糖检测发现,clp突变株的胞外多糖产量减少。利用剪叶接种法接种感病寄主IR24,突变体的致病能力降低；不过和野生型菌株一样,突变株也能激发非寄主的烟草过敏性反应。推测clp基因与水稻白叶枯病菌的毒力,鞭毛活动能力和趋化性相关。

全文目录


摘要  8-9ABSTRACT  9-11第一部分 文献综述  11-29  第一章 水稻黄单胞菌致病机理研究进展  11-19    1 水稻黄单胞菌概述  11-12    2 植物病原细菌致病相关基因  12-13    3 黄单胞菌的主要致病生化因子  13-16      3.1 多糖  13      3.2 毒素  13-14      3.3 胞外酶  14      3.4 依赖于hrp基因的效应分子  14-15      3.5 依赖于dsp基因的效应分子  15      3.6 生长激素  15-16    4 水稻白叶枯病菌的基因组结构  16    5 基因的水平转移与病原菌的进化  16-17    6 病原菌致病生化因子的调控  17-19      6.1 群体感应调节系统  17-18      6.2 双组分调控系统  18-19  第二章 可扩散性信号分子DSF的研究进展  19-27    1 DSF调节单元及依赖DSF的生物学功能  19-20    2 RpfC和RpfG组成一个双组分系统来感应和转换DSF信号  20    3 DSF信号传导受到第二信使cyclic-di-GMP的调节  20-21    4 全局性转录调节因子Clp与DSF信号传导有关  21    5 Clp通过多级调控网络调节DSF的信号传导  21-22    6 DSF类型QS系统在其它细菌种类中的保守性  22-27  第三章 结论和展望  27-29第二部分 研究内容  29-79  第一章 水稻细菌性条斑病菌clp基因的克隆及功能研究  29-55    1 材料与方法  30-43      1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物  30      1.2 培养基及抗生素  30-32      1.3 细菌基因组DNA的提取  32-33      1.4 质粒的提取  33-34      1.5 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  34      1.6 DNA酶切、连接和PCR扩增产物回收  34-35      1.7 质粒的转化  35-36      1.8 PCR反应  36-37      1.9 整合突变体的构建  37-38      1.10 互补菌株的构建  38-40      1.11 胞外纤维素酶的检测  40      1.12 铁载体(siderophore)的检测  40      1.13 生物膜的检测  40      1.14 胞外多糖(EPS)的检测  40-41      1.15 游动性和趋化应答试验  41      1.16 细胞形态和鞭毛观察  41      1.17 烟草过敏反应和致病性的测定  41      1.18 总RNA的提取及RT-PCR扩增  41-43      1.19 序列分析  43    2 结果与分析  43-53      2.1 clp基因的克隆  43-44      2.2 clp基因的序列分析  44-45      2.3 clp基因突变株的构建  45      2.4 clp互补菌株的构建  45-47      2.5 clp基因的突变不影响Rs105正常生长  47      2.6 clp基因突变后不影响胞外纤维素酶的产生  47-48      2.7 clp基因突变后未能影响细菌铁载体(siderophore)的产生  48      2.8 clp基因与水稻细菌性条斑病菌生物膜的形成有关  48-49      2.9 clp基因的突变未能改变细胞形态  49      2.10 clp基因突变后影响胞外多糖(EPS)的产生  49-50      2.11 clp基因对水稻细菌性条斑病菌游动性和鞭毛活力很重要  50-51      2.12 clp基因的突变体丧失趋化性  51      2.13 clp基因突变影响条斑病菌的致病性,但不影响过敏性反应  51-52      2.14 RT-PCR检测结果  52-53    3 讨论与结论  53-55      3.1 clp基因可能与胞外多糖产生相关  53      3.2 clp基因可能与细菌性条斑病菌鞭毛活力,游动性和趋化性相关  53-54      3.3 clp基因与细菌性条斑病菌致病性相关,但不影响过敏性反应  54-55  第二章 水稻白叶枯病菌clp基因的克隆与功能验证  55-71    1 材料与方法  56-58      1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物  56-57      1.2 培养基及抗生素  57      1.3 细菌基因组DNA、质粒的提取  57      1.4 质粒的转化  57      1.5 缺失突变体的构建  57      1.6 互补菌株的构建  57      1.7 胞外纤维素酶的检测  57      1.8 铁载体(siderophore)的检测  57      1.9 生物膜的检测  57      1.10 胞外多糖(EPS)的检测  57-58      1.11 游动性和趋化应答试验  58      1.12 细胞形态和鞭毛观察  58      1.13 HR和致病性的测定  58      1.14 总RNA的提取及RT-PCR扩增  58      1.15 序列分析  58    2 结果与分析  58-68      2.1 clp基因的克隆  58-59      2.2 clp基因的序列分析  59-60      2.3 clp突变株的构建  60-62      2.4 互补菌株的构建  62      2.5 clp基因的突变不影响白叶枯菌正常生长  62-63      2.6 clp基因突变后没有影响胞外维素酶的产生  63-64      2.7 clp基因缺失突变后影响细菌铁载体(siderophore)的产生  64      2.8 clp基因的突变对白叶枯病菌的生物膜形成有影响  64-65      2.9 clp基因突变后影响胞外多糖(EPS)的产生  65      2.10 clp基因的突变未能改变细胞形态  65-66      2.11 clp基因对鞭毛活性起重要作用  66-67      2.12 clp基因的突变体丧失趋化性  67      2.13 clp基因的突变影响PXO99致病性,但不影响烟草过敏性反应  67      2.14 RT-PCR检测结果  67-68    3 讨论与结论  68-71      3.1 clp基因可能与胞外多糖产生相关  68-69      3.2 clp基因可能影响鞭毛的活力进而影响游动性和趋化性  69      3.3 clp基因与水稻白叶枯病菌致病性相关,对过敏性反应没有影响  69-71  第三章 水稻白叶枯菌clp基因缺失与插入突变比较  71-79    1 材料和方法  71-73      1.1 菌株、质粒和引物  71-72      1.2 培养基及抗生素  72      1.3 细菌基因组DNA、质粒的提取  72      1.4 酶切、连接  72      1.5 质粒的转化  72      1.6 两亲交配  72      1.7 整合突变体的构建  72-73      1.8 互补菌株的构建  73      1.9 突变体在MMX中的生长情况测定  73      1.10 烟草过敏反应和致病性的测定  73    2 结果与分析  73-77      2.1 clp基因插入突变株的构建  73-74      2.2 PCR验证  74-75      2.3 两种突变株没有影响细菌的正常生长  75      2.4 两种突变株都减弱细菌致病性  75-76      2.5 两种突变株与胞外纤维素酶的关系  76      2.6 两种突变株其他功能的检测  76-77    3 讨论与结论  77    下一步工作设想  77-79发表或待发表的论文  79-81参考文献  81-89附录  89-101致谢  101

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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