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猪β-防御素-2的重组表达及体外抑菌和抗病毒试验研究

作　者: 徐海涛
导　师: 马立保
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 猪β-防御素-2 原核表达 抗菌活性 抗病毒活性
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 85次
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内容摘要


哺乳动物防御素是动物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类重要的抗菌肽物质,具有十分广泛的抗菌谱,在先天免疫上起重要作用。本研究参照Veldhuizen等（2008）人工合成的pBD-2氨基酸序列重组表达了含有37个氨基酸的猪β-防御素-2（37）（pBD-2（37））和参照pBD-2的直系同源基因hBD-1的成熟肽序列重组表达了含有36个氨基酸的猪β-防御素-2（36）（pBD-2（36））。然后,在体外研究了pBD-2（36）和pBD-2（37）的抑菌活性以及pBD-2（37）的溶血活性和抗病毒活性。1.猪β-防御素-2（pBD-2）的重组表达及纯化1.1 pBD-2（37）的重组表达及纯化根据已报道的pBD-2基因的cDNA序列,参照Veldhuizen等（2008）人工合成的pBD-2序列,合成了三条基因片段（1,2,3）。片段1、2和片段2、3各有15个碱基互补配对,PCR扩增延伸得到pBD-2（37）基因,将pBD-2（37）基因重组于原核表达载体pGEX-KG,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式表达。表达纯化后的pBD-2（37）融合蛋白经凝血酶酶切后,过Sephadex G-25柱层析,SDS-PAGE分析,获得约3.8 kDa的目的蛋白pBD-2（37）。1.2 pBD-2（36）的重组表达及纯化根据已报道的pBD-2基因的cDNA序列,参照pBD-2的直系同源基因hBD-1的成熟肽序列,合成了三条基因片段（1,2,3′）。片段3′比片段3少三个碱基（gcg）,片段1、2和片段2、3′各有15个碱基互补配对,PCR扩增延伸得到pBD-2（36）基因,将pBD-2（36）基因重组于原核表达载体pGEX-KG,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式表达。表达纯化后的pBD-2（36）融合蛋白经凝血酶酶切后,过Sephadex G-25柱层析,SDS-PAGE分析,获得约3.8 kDa的目的蛋白pBD-2（36）。2.pBD-2（37）的溶血活性和抗病毒活性研究将13.0μg/mL、26.0μg/mL和52.0μg/mL的pBD-2（37）与猪红细胞作用1 h后,在450 nm下,测定吸光值。结果发现,与PBS（pH=7.2）对照相比,13.0μg/mL、26.0μg/mL和52.0μg/mL的pBD-2（37）对猪红细胞均有溶血活性,26.0μg/mLpBD-2（37）比13.0μg/mL pBD-2（37）溶血现象明显（P＜0.001）,26.0μg/mL pBD-2（37）和52.0μg/mL pBD-2（37）的溶血活性差异不显著（P＞0.05）。抗病毒试验结果表明,pBD-2（37）（52.0μg/mL）对有囊膜的猪伪狂犬病毒（PRV）没有抑制效果。3.pBD-2（37）和pBD-2（36）的抗菌活性研究调整琼脂内的细菌终浓度为106CFU/mL,在琼脂板上打直径为约5 mm的圆孔,加入0.1 mL 52.0μg/mL pBD-2于圆孔中。结果表明,pBD-2（37）（52.0μg/mL）对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用,对致病性大肠杆菌（E.coli O138）有轻微的抑制作用,对副猪嗜血杆菌（分离株Ⅴ型）抑制作用不明显。pBD-2（36）（52.0μg/mL）对致病性大肠杆菌（E.coli O138）有轻微的抑制作用,对金黄色葡萄球菌和副猪嗜血杆菌（分离株Ⅴ型）则没抗菌活性。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表  10-11
第一章 文献综述  11-20
  1 动物防御素的研究进展  11-16
    1.1 动物防御素的分布及表达  11-12
    1.2 动物防御素的分子结构  12-13
    1.3 动物防御素的抗菌活性及影响因素  13-14
    1.4 动物防御素的抗菌机理  14
    1.5 动物防御素的抗病毒活性  14-15
    1.6 动物防御素的细胞毒性作用  15
    1.7 防御素类抗菌肽在畜牧生产中的应用  15-16
  2 猪β-防御素的研究概况  16-19
    2.1 猪β-防御素的结构  16-18
    2.2 猪β-防御素的分布及表达  18
    2.3 猪β-防御素抑制细菌和病毒的活性  18-19
  3 研究目的和意义  19-20
第二章 猪β-防御素-2的重组表达及体外抑菌和抗病毒试验研究  20-47
  1 材料与方法  20-33
    1.1 材料  20-24
      1.1.1 质粒和菌株  20
      1.1.2 病毒和细胞  20
      1.1.3 主要仪器设备  20-21
      1.1.4 主要试剂及配制  21-23
      1.1.5 主要应用的软件  23-24
    1.2 方法  24-33
      1.2.1 猪pBD-2基因片段的设计  24-25
      1.2.2 猪pBD-2基因PCR扩增  25
      1.2.3 大肠杆菌DH5α或BL21(DE3)感受态细胞的制备(CaCl_2法)  25-26
      1.2.4 pBD-2/pGEX-KG重组表达质粒的构建、转化  26-27
      1.2.5 pBD-2/DGEX-KG重组表达质粒的鉴定  27
      1.2.6 重组子pBD-2/pGEX-KG的诱导表达  27-28
      1.2.7 表达产物的SDS-PAGE分析  28-29
      1.2.8 表达产物的提取以及融合蛋白的纯化  29-30
      1.2.9 蛋白的浓度测定  30
      1.2.10 融合蛋白的酶切  30
      1.2.11 酶切后蛋白的凝胶过滤层析  30-31
      1.2.12 pBD-2对猪红细胞的溶血活性  31
      1.2.13 pBD-2的抑菌活性检测  31-32
      1.2.14 pBD-2的抗病毒活性  32-33
  2 结果与分析  33-42
    2.1 pBD-2的PCR扩增  33
    2.2 pBD-2PCR扩增产物的双酶切  33
    2.3 pGEX-KG载体的双酶切  33-34
    2.4 pBD-2/DGEX-KG重组表达质粒的鉴定  34-36
      2.4.1 pBD-2/DGEX-KG重组表达质粒的PCR鉴定  34
      2.4.2 pBD-2/DGEX-KG重组表达质粒的双酶切鉴定  34-35
      2.4.3 pBD-2/DGEX-KG重组表达质粒的测序鉴定  35-36
    2.5 表达产物的SDS-PAGE分析  36-37
    2.6 表达产物的纯化和融合蛋白的酶切  37-39
      2.6.1 融合蛋白的SDS-PAGE分析  38-39
      2.6.2 融合蛋白酶切后的SDS-PAGE分析  39
    2.7 酶切后蛋白的凝胶过滤层析  39-40
    2.8 pBD-2对猪红细胞的溶血活性  40
    2.9 pBD-2的抑菌活性检测  40-41
    2.10 pBD-2的抗病毒活性检测  41-42
  3 讨论  42-46
    3.1 猪β-防御素的重组表达  42-43
    3.2 基因片段的合成  43
    3.3 表达系统的选择  43-44
    3.4 pBD-2对猪红细胞的溶血活性  44
    3.5 pBD-2的抑菌和抗病毒活性  44-46
  4 结论  46
  5 本试验的创新点与不足  46-47
参考文献  47-54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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