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重组人非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点修饰研究

作　者: 郝素娟
导　师: 马润宇；苏志国
学　校: 北京化工大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 促红细胞生成素 非糖基化 PEG修饰 PEG-丙醛
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


促红细胞生成素(Epo)是一种促进红系造血前体细胞分化、繁殖的细胞因子,在临床上主要用于治疗慢性肾功能衰竭(CRF)、艾滋病人及肿瘤病人化疗引起的贫血等,疗效极为显著。Epo是一种含有166个氨基酸的糖蛋白,糖基对于蛋白质的稳定性维持和体内活性至关重要。目前临床使用的重组人促红细胞生成素(rhEpo)均为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的糖蛋白,但CHO表达体系生产成本高、产量低,而大肠杆菌表达系统具有生长速度快、周期短、培养条件简单、价格低廉等优点。虽然以大肠杆菌表达的无糖链促红细胞生成素(rh-ngEpo)丧失了体内生物活性,但是这一点可以通过PEG修饰技术来弥补。PEG修饰通过减少肾清除、降低免疫原性、减少酶解等改善蛋白药物的药代动力学性质,提高蛋白药物的循环半衰期,增强体内药效,目前已成功用于多种蛋白药物的长效制剂研发。为实现对蛋白质N末端的定点修饰和提高蛋白修饰后的活性保留,本论文采用分子量为20 kDa和30 kDa的单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对rh-ngEpo进行修饰。论文考察了各种反应条件对修饰效果的影响,得到了最佳反应条件,即在4℃时,20 mmol/LPB,0.5 mol/L甘露醇,pH 6.0溶液中,蛋白浓度为1 mg/mL, PEG/rh-ngEpo摩尔比为10：1,NaBH3CN/PEG摩尔比为10：1,反应24 h后,单修饰率可达到55%。用一步离子交换色谱法对反应混合物进行分离纯化,得到纯度在95%以上的单修饰产物。对单修饰产物理化性质和修饰位点进行研究,发现其二、三级结构与原蛋白一致。肽图分析表明绝大部分的PEG修饰在了蛋白N-末端氨基酸残基上。ELISA活性分析表明单修饰产物的体外活性比修饰前分别减少了30%和45.6%。稳定性实验表明PEG修饰显著增强了原蛋白的热稳定性。药代动力学实验结果表明PEG提高了rh-ngEpo的代谢稳定性。综上所述,我们优化了mPEG-ALD修饰rh-ngEpo的最佳反应条件,有效分离出单修饰产物,确定了偶联产物的结构、理化性质及药代动力学性质,研究结果表明PEG可以在一定程度上替代糖基的作用。PEG修饰的非糖基化Epo有望成为一种新型的促红细胞生成蛋白药物。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-15
第一章 文献综述  15-41
  1.1 蛋白类药物  15
    1.1.1 蛋白类药物的研究现状  15
    1.1.2 蛋白药物存在的问题  15
  1.2 蛋白质的聚乙二醇修饰  15-22
    1.2.1 聚乙二醇(PEG)简介  16-17
    1.2.2 PEG化化学  17-22
      1.2.2.1 第一代PEG化化学  18
      1.2.2.2 第二代PEG化化学  18-22
  1.3 PEG修饰技术的主要发展趋势和现状  22-24
    1.3.1 pH控制的氨基定点修饰  23
    1.3.2 羰基定点修饰  23
    1.3.3 基于氨基保护的定点修饰  23
    1.3.4 二硫键定点修饰  23-24
    1.3.5 非极性氨基酸定点修饰  24
    1.3.6 其他定点修饰方法  24
  1.4 修饰后蛋白性质的改变  24-25
  1.5 影响PEG修饰反应的因素  25-29
    1.5.1 蛋白质的性质  26
    1.5.2 修饰剂的选择  26-27
    1.5.3 反应条件的选择  27-29
      1.5.3.1 反应介质  27-28
      1.5.3.2 修饰反应的pH值和离子强度  28
      1.5.3.3 PEG与蛋白质的摩尔比  28
      1.5.3.4 蛋白浓度  28
      1.5.3.5 反应时间  28
      1.5.3.6 反应温度  28-29
  1.6 聚乙二醇修饰产物的分离纯化  29-32
    1.6.1 分子排阻层析  29-30
    1.6.2 离子交换层析  30-31
    1.6.3 疏水相互作用层析  31
    1.6.4 亲和层析  31-32
  1.7 修饰蛋白的分析与表征  32-33
    1.7.1 蛋白浓度的测定  32
    1.7.2 SDS-PAGE分析  32
    1.7.3 分子量的测定和分析  32-33
    1.7.4 PEG化位点的分析  33
      1.7.4.1 PEG化位点的鉴定  33
      1.7.4.2 位点异构体的分离方法  33
  1.8 PEG修饰蛋白质的应用及局限性  33-35
    1.8.1 PEG修饰蛋白的应用  34-35
    1.8.2 PEG修饰蛋白的局限性及发展方向  35
  1.9 促红细胞生成素的研究进展  35-39
    1.9.1 促红细胞生成素简介  35-36
    1.9.2 Epo的结构  36-37
    1.9.3 Epo在临床上的应用  37-39
      1.9.3.1 慢性肾病  37
      1.9.3.2 获得性免疫缺陷综合症(AIDS)  37-38
      1.9.3.3 肿瘤  38
      1.9.3.4 丙型肝炎(HCV)感染  38
      1.9.3.5 中枢神经系统疾病  38-39
  1.10 主要实验思路及技术路线  39-41
第二章 促红细胞生成素的聚乙二醇修饰  41-59
  2.1 材料和仪器  41-44
    2.1.1 实验材料  41-42
    2.1.2 仪器设备  42
    2.1.3 主要试剂  42-44
      2.1.3.1 培养基  42-43
      2.1.3.2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制  43
      2.1.3.3 磷酸缓冲液的配制  43-44
      2.1.3.4 氰基硼氢化钠溶液  44
      2.1.3.5 甘氨酸溶液  44
  2.2 实验方法  44-50
    2.2.1 工程菌的培养发酵  44
      2.2.1.1 摇瓶种子培养  44
      2.2.1.2 摇瓶发酵培养  44
      2.2.1.3 发酵罐培养  44
    2.2.2 包涵体的制备  44-45
    2.2.3 rh-ngEpo蛋白纯品的制备  45
      2.2.3.1 rh-ngEpo包涵体的变性与复性  45
      2.2.3.2 rh-ngEpo的纯化  45
    2.2.4 20kDa mPEG-ALD修饰rh-ngEpo反应条件的优化  45-47
      2.2.4.1 稳定剂的影响  45-46
      2.2.4.2 pH值的影响  46
      2.2.4.3 修饰剂与蛋白质配比的影响  46
      2.2.4.4 蛋白浓度的影响  46
      2.2.4.5 还原剂比例的影响  46-47
      2.2.4.6 反应时间的影响  47
    2.2.5 检测方法  47-50
      2.2.5.1 蛋白浓度测定  47
      2.2.5.2 还原型SDS-PAGE  47-49
      2.2.5.3 高效凝胶过滤色谱(HPSEC)检测  49
      2.2.5.4 反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测  49-50
      2.2.5.5 修饰转化率的计算  50
  2.3 结果和讨论  50-57
    2.3.1 重组人促红细胞生成素的诱导表达  50-51
    2.3.2 rh-ngEpo的复性与纯化  51-52
    2.3.3 20kDa mPEG-ALD修饰rh-ngEpo反应条件的优化结果  52-57
      2.3.3.1 稳定剂  52-53
      2.3.3.2 pH值  53
      2.3.3.3 修饰剂/蛋白的配比  53-54
      2.3.3.4 蛋白浓度  54-55
      2.3.3.5 还原剂比例  55
      2.3.3.6 反应时间  55-56
      2.3.3.7 30kDa mPEG-ALD的修饰  56-57
  2.4 本章小结  57-59
第三章 聚乙二醇化促红细胞生成素的分离纯化  59-67
  3.1 材料和仪器  59-60
    3.1.1 实验材料  59-60
    3.1.2 仪器设备  60
    3.1.3 主要试剂  60
  3.2 实验方法  60-62
    3.2.1 修饰产物的分离纯化  60-61
      3.2.1.1 20kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化  60-61
      3.2.1.2 30kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化  61
    3.2.2 检测方法  61-62
      3.2.2.1 SDS-PAGE  61
      3.2.2.2 高效凝胶过滤色谱检测  61
      3.2.2.3 反相高效液相色谱检测  61-62
  3.3 结果与讨论  62-65
    3.3.1 20kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化  62-63
    3.3.2 30kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化  63-64
    3.3.3 单修饰产物的HPSEC和RP-HPLC分析  64-65
  3.4 本章小结  65-67
第四章 聚乙二醇化促红细胞生成素的性质考察  67-79
  4.1 材料和仪器  67-68
    4.1.1 实验材料  67
    4.1.2 仪器设备  67-68
  4.2 实验方法  68-71
    4.2.1 MALDI-TOF MS测定分子量  68
    4.2.2 二级结构的测定  68
    4.2.3 分子构象的测定  68-69
      4.2.3.1 荧光光谱法及其检测分析原理  69
      4.2.3.2 操作方法  69
    4.2.4 修饰位点的确定  69
    4.2.5 热稳定性实验  69
    4.2.6 体外活性的测定(酶联免疫法,ELISA)  69-70
    4.2.7 循环半衰期的测定  70
    4.2.8 检测方法  70-71
      4.2.8.1 蛋白浓度的测定  70
      4.2.8.2 高效凝胶过滤色谱检测  70
      4.2.8.3 反相高效液相色谱检测  70-71
  4.3 结果与讨论  71-77
    4.3.1 MALDI-TOF MS测定分子量  71-72
    4.3.2 圆二色谱和荧光图谱  72-73
    4.3.3 修饰位点分析  73-75
    4.3.4 热稳定性实验  75
    4.3.5 体外活性  75-76
    4.3.6 药代动力学的考察  76-77
  4.4 本章小结  77-79
第五章 结论与展望  79-81
  5.1 研究总结  79-80
  5.2 工作展望  80-81
参考文献  81-89
作者及导师简介  89-91
研究成果及发表的学术论文  91-93
致谢  93

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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