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mPEG修饰对产朊假丝酵母与一种未鉴定念珠菌尿酸酶的影响

作　者: 孙晓军
导　师: 廖飞
学　校: 重庆医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 高尿酸血症尿酸酶 PEG修饰半衰期
分类号: R589.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

尿酸是人体嘌呤碱基分解代谢终产物,主要经肾脏排泄。尿酸溶解度低;当人体内尿酸生成超过肾脏排泄能力时血清尿酸会显著升高,引起高尿酸血症而危害人体健康。尿酸酶可将尿酸转变成人体可耐受或没有明显病理生理作用的产物;人体无尿酸酶,故外源尿酸酶是治疗高尿酸血症相关疾病的潜在蛋白质药物。外源尿酸酶有免疫原性,且在体内半衰期很短。用mPEG修饰尿酸酶可降低其免疫原性,且经mPEG修饰后其肾小球过滤减少也不易被蛋白酶降解,这些特性均有助于延长药用尿酸酶在体内的循环半衰期。本文用mPEG修饰产朊假丝酵母尿酸酶及一种热稳定更好的未鉴定念珠菌尿酸酶,比较两种尿酸酶修饰后的热稳定性、首次给药体内循环半衰期,以期获得治疗高尿酸血症的药用尿酸酶制剂。对这两种尿酸酶进行了如下研究:1.产朊假丝酵母菌尿酸酶和未鉴定念珠菌尿酸酶的制备以产朊假丝酵母菌(武汉大学中国典型培养物菌种保藏中心, AY 204007)的基因组DNA为模板,PCR扩增尿酸酶基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,测序正确后,再把构建好的重组原核表达载体PET28a-Uricase转化到BL21(DE3)中,以IPTG为诱导剂,18℃诱导目的蛋白表达。离心收集菌体,超声粉碎,离心,取上清即粗酶液,经30%到90%硫酸铵分级,DEAE-纤维素在pH 9.0时吸附杂蛋白后得重组表达产朊假丝酵母尿酸酶。未鉴定念珠菌(中国普通微生物菌种保藏中心,C.G.M.C.C. 2.1008)经0.5%尿酸诱导培养,离心收集菌体,超声破碎,后取上清即粗酶液;再经30%到90%硫酸铵分级,DEAE-纤维素pH 9.0时吸附杂蛋白两次后,比活性达10.0 U/mg蛋白。2.两种尿酸酶的动力学参数重组表达的产朊假丝酵母尿酸酶米氏常数为(36±5)μmol/L (n = 3),黄嘌呤的抑制常数为(11.3±0.4)μmol/L(n = 3)。未鉴定念珠菌尿酸酶米氏常数为(33±3)μmol/L(n = 3),黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.5)μmol/L(n = 3)。3.两种尿酸酶的酶学性质和首次给药的在体循环半衰期比较以mPEG作为修饰剂分别修饰两种尿酸酶,比较两种尿酸酶修饰前后的最适pH值、最适温度、稳定性及首次给药在体内半衰期。此重组表达产朊假丝酵母菌尿酸酶最适温度为40℃、最适pH为8.5;PEG修饰后最适温度35℃、最适pH为8.7;此尿酸酶在37℃,pH 9.0时稳定性差,修饰前后半衰期分别为2 h与4 h左右,在37℃,pH 7.4时修饰前后半衰期仅40 min与80 min左右,难以药用。未鉴定的念珠菌尿酸酶经PEG修饰后,最适温度由30℃上升为35℃;最适pH仍为pH8.7;在37℃,pH9.0条件下,24h后活性保留由40%增至85%,在实验大鼠体内首次给药半衰期由15 min延长至11 h。此未鉴定念珠菌尿酸酶经mPEG修饰后有药用潜力。

全文目录

符号说明  5-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-14
第一部分产朊假丝酵母尿酸酶制备  14-24
  1 材料与方法  14-21
  2 结果  21-23
  3 讨论  23-24
第二部分未鉴定念珠菌尿酸酶的制备  24-30
  1 材料与方法  24-27
  2 结果  27-28
  3 讨论  28-30
第三部分两种尿酸酶的mPEG 修饰前后比较  30-41
  1 材料与方法  30-33
  2 结果  33-39
  3 讨论  39-41
全文总结  41-42
参考文献  42-45
致谢  45

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