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microRNA-1在喉鳞状细胞癌HEp2细胞中靶向调节fibronectin1基因

作　者: 王菲菲
导　师: 刘民
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 微小RNA microRNA-1 抑癌基因人类喉鳞状细胞癌靶基因纤维连接蛋白1
分类号: R739.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的微小RNA (microRNA, miRNA)是一类广泛存在的在转录后水平调节基因表达的小分子非编码RNA,参与多种生理和病理过程。近来研究表明, miRNAs主要是通过特异性识别信使RNAs (messenger RNAs, mRNAs)的3,-非翻译区(3’-untranslated regions,3’-UTRs)发挥调节作用的。其中,某些miRNA还具有癌基因或抑癌基因的活性,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。前期本实验室利用寡核苷酸微阵列技术,发现在人类喉鳞状细胞癌组织中microRNA-1(miR-1)表达水平显著下调。本课题进一步研究了miR-1对喉鳞状细胞癌HEp2细胞生长表型的影响,并预测及验证了miR-1直接作用的靶基因,以期探寻miR-1对喉鳞状细胞癌发生和发展作用的分子机制。方法在人类喉鳞状细胞癌细胞系HEp2细胞中,过表达和封闭内源性miR-1的功能后,利用MTT实验和克隆形成实验检测细胞生长活性的变化。而后综合利用生物信息学方法和cDNA微阵列技术筛选miR-1的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-1对靶基因的直接调控作用。通过real-time PCR、Western blot和免疫荧光实验检测miR-1过表达和封闭后的喉鳞癌HEp2细胞中靶基因mRNA和蛋白水平的表达变化,进一步验证miR-1对靶基因的调控作用。同时,采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术在HEp2细胞中沉默靶基因的表达,检测其对细胞生长表型的影响。结果在人类喉鳞癌HEp2细胞中,过表达miR-1的初始转录本pri-1后,细胞生长明显受到抑制,而且克隆形成能力明显降低；而以反义互补的寡核苷酸(ASO-1)封闭miR-1后,细胞生长活性增加,克隆形成能力也有所上升。靶基因筛选结果表明,纤维连接蛋白1(fibronectin1, FN1)是miR-1的候选靶基因,其3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)包含miR-1的潜在结合位点。荧光报告载体实验表明,miR-1能够通过作用于FN1基因3’-UTR的特定结合位点,对其表达进行负性调节。此外,real-time PCR、Western blot和免疫荧光实验证明,过表达miR-1可以下调靶基因的mRNA和蛋白水平,而封闭miR-1后,靶基因的mRNA和蛋白水平均有升高。采用RNAi技术沉默内源性FN1后,细胞的生长活性和克隆形成能力下降,这与过表达miR-1的结果相一致。结论在人类喉鳞状细胞癌HEp2细胞中,miR-1能够通过抑制细胞的生长活性,起到抑癌基因的作用；miR-1通过靶定FN1基因的3’-UTR区调节喉鳞癌HEp2细胞的生长活性；FN1可促进细胞的生长活性,可能发挥了癌基因的功能。通过研究miR-1在喉鳞癌细胞系中的具体作用机制,有利于我们对恶性肿瘤的发生和发展进行深入地了解,同时也为miRNAs作为肿瘤早期诊断和治疗的分子标记物提供新的线索。

microRNA-1在喉鳞状细胞癌HEp2细胞中靶向调节fibronectin1基因

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