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日粮能量来源对大鼠初情启动的影响及调控机理研究

作　者: 李方方
导　师: 吴德
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 能量来源 KISS1 GPR54 初情启动 繁殖性能 信号途径
分类号: S865.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本研究通过大鼠生长试验与原代神经元细胞培养模型相结合,探讨饲喂不同能量来源日粮对大鼠初情启动和代谢激素Insulin、Leptin及相关基因表达的影响,阐明代谢激素Leptin与弓状核(Arcuate nucleus, ARC)初情启动关键信号KISS1/GPR54之间的关系。进一步通过体外试验,深入研究Leptin对ARC核神经细胞KISS1/GPR54表达调控的分子机制。共计开展了四个试验。试验一日粮能量来源对大鼠初情启动及下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴中KISS1/GPR54系统的影响为了研究日粮能量来源对大鼠初情启动及KISS1/GPR54系统的影响,本试验选用60只体重相近的断奶大鼠,采用单因子完全随机化设计,共分3个处理组,分为淀粉组、油脂组、AIN93标准日粮组。每个处理20个重复,每个重复1只大鼠。饲喂时间由断奶到初情。结果表明：1、油脂组大鼠初情启动早于标准日粮组和淀粉组(P<0.05)。油脂组与标准日粮组、淀粉组相比显著提高了大鼠腹脂重和腹脂率(P<0.05)。2、油脂组与淀粉和标准日粮组相比提高大鼠血清游离脂肪酸、甘油三酯的含量(P<0.05)。3、油脂组显著提高大鼠血液Leptin浓度(p<0.05)。4、油脂组大鼠初情期血液GnRH、LH、E2含量高于标准日粮组和淀粉组(P<0.05)。能量来源对大鼠血液FSH、P4含量影响差异不显著(P>0.05)。5、油脂组大鼠28日龄ARC核KISS1基因表达提高(P<0.05)。6、油脂组大鼠初情期GnRH基因在AVPV表达提高；AVPV、垂体、卵巢KISS1、 GnRH-R基因表达提高；GPR54基因在AVPV、垂体的表达提高,但卵巢中未检出；垂体LH-R、FSH-R基因表达提高。结果显示：日粮能量来源显著影响大鼠的初情启动,日粮中添加油脂可以通过提高血液中Leptin浓度,上调大鼠ARC核KISS基因表达,提早大鼠初情日龄。同时油脂提高了HPG轴上初情期KISS1基因表达及垂体LH-R、FSH-R基因的表达。试验二、体外培养ARC神经元中Insulin对KISS1/GPR54表达的影响研究试验一发现日粮中添加油脂上调大鼠ARC核KISS1基因表达,提早大鼠初情日龄。为了单独研究Insulin对体外原代培养的下丘脑ARC神经元细胞中KISS1、GPR54、 GnR1H表达的影响,我们开展试验二,采用单因子试验设计,试验设计为15个处理,每个处理设3个重复。在同一作用时间下,根据大鼠生理条件下血液中Isulin含量为1～10mg/ml设计添加的梯度浓度,Insulin终浓度分别为：0、5、10、20、40、80、100mg/ml。并在同一作用浓度下考察不同作用时间0、2、4、6、8、10、12h Isulin对大鼠KISS1、GPR54、GnRIH等基因表达的影响。试验共用胚胎鼠320只左右。结果表明：1、成功获得体外原代培养的ARC神经元细胞。2、与对照组相比,生理剂量的Insulin处理对KISS1mRNA的表达量没有影响,但高浓度的(80、100mg/ml)、长时间(10、12h)的Insulin处理显著抑制了KISS1mRNA的表达量(P<0.05),但20mg/ml的Insulin处理显著提高了GPR54mRNA的表达(P<0.05)。3、Insulin处理显著提高了GnRH、GnRH-R mRNA的表达和GnRH激素在神经元细胞中的分泌(P<0.05)。4、Insulin处理提高了胰岛素受体(I-R) mRNA的表达(P<0.05)。以上结果显示：Insulin对动物初情启动关键基因KISSI的表达没有促进作用,Insulin可提高ARC神经元GnRH分泌。试验三、体外培养ARC神经元中Leptin对KISS1/GPR54表达的影响研究试验一发现油脂日粮提早大鼠初情日龄,这种作用是否通过Leptin在ARC核神经元直接调控KISS1基因的表达实现的还有待证实,本试验旨在研究Leptin对ARC神经元细胞中(?)CISS1、GPR54、GnR1H表达的剂量效应和时间效应。试验采用单因子实验设计,试验设计为16个处理,每个处理设3个重复。在同一作用时间下,根据大鼠生理条件下血液中Leptin含量为0.7～2.1ng/ml设计添加的梯度浓度,Leptin终浓度分别为:0、0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20ng/ml。并在同一作用浓度下考察不同作用时间0、2、4、6、8、10、12h对大鼠KISS1、GPR54、GnRH等基因表达的影响。试验共用胚胎鼠360只左右。结果表明：1、Leptin剂量和时间处理都显著的增加了KISS1mRNA的表达(P<0.05)；0.3ng/ml的Leptin处理显著的增加了GPR54mRNA的表达(P<0.05)2、0.3ng/ml的Leptin处理显著的增加了GnRH、GnRH-R、Ob-Rb mRNA的表达(P<0.05)。3、Leptin处理显著的降低了IR mRNA的表达量(P<0.05)。4、0.3ng/ml的Leptin处理极显著的增加了GnRH激素的分泌(P<0.01)。以上结果表明：Leptin可以直接作用于ARC核神经元细胞,显著提高KISS1、GPR54及Ob-Rb基因表达,从而增加GnRH, GnRH-R基因表达和GnRH激素的分泌。试验四、Leptin调控Kisspeptin/GPR54的细胞内信号传导途径研究本试验旨在进一步研究Leptin是否通过JAK2/STAT3信号途径调控KISS1/GPR54系统表达。AG490可以阻断信号分子JAK2的活化,本试验通过AG490处理阻断JAK2/STAT3信号途径后,研究Leptin对ARC神经元细胞KISS1基因、蛋白表达的影响。试验共用胚胎鼠200只左右。结果表明：1、5μM的AG490处理显著的降低了pJAK2蛋白的表达(P<0.05)。2、与未处理组相比,0.3、0.6ng/ml的Leptin处理显著的增加了pJAK2、pSTST3、 kisspeptin蛋白表达(P<0.05),5μM pJAK2特异性抑制剂AG490的使添加使Leptin处理后PJAK2、pSTAT3、kisspeptin蛋白表达降低到未处理组水平。3、0.3、0.6ng/ml Leptin处理上调(?)(ISS1mRNA表达(P<0.01),添加5μM的AG490处理后KISS1mRNA表达下降到未处理水平。4、0.3、0.6ng/ml Leptin后促进GnRH激素的分泌(P<0.05),添加5μM的AG490处理后GnRH激素分泌下降到未处理水平。以上结果表明：Leptin通过JAK2/STAT3信号途径调控kisspeptin蛋白的表达,进而调控GnRH激素的分泌。综上所述,可以结论：日粮中添加油脂可以通过提高血液中Leptin浓度,上调大鼠ARC核KISS1/GPR54基因表达,提早大鼠初情日龄。同时油脂提高了HPG轴上初情期KISS1基因表达及垂体LH-R、FSH-R基因的表达。Leptin可以直接作用于ARC核神经元细胞,显著提高K(ISS1、GPR54基因表达,从而增加GnRH, GnRH-R基因表达及GnRH激素分泌。Leptin通过JAK2/STAT3信号途径调控kisspeptin蛋白的表达,从而调控GnRH激素的分泌。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-12
缩略词表  12-18
一、前言  18
二、文献综述  18-32
  1、KISS1/GPR54信号系统简介  18-19
  2、KISS1/GPR54系统对初情启动的调控作用及机理  19-29
    2.1 动物下丘脑垂体性腺轴系统  19-20
    2.2 KISS1/GPR54系统对初情启动的关键性调控作用  20-22
    2.3 KISS1/GPR54系统调控动物初情启动的机理  22-25
    2.4 营养对代谢激素和动物初情启动的影响  25-29
  3、KISS1/GPR54系统细胞信号转导途径  29-31
  4、主要存在的问题  31-32
三、本研究的目的、意义和内容  32-34
  3.1 研究目的  32
  3.2 研究意义  32
  3.3 研究内容  32-33
  3.4 技术路线  33-34
四、试验研究  34-93
  试验一、日粮能量来源对大鼠初情启动及HPG轴中KISS1/GPR54系统的影响  34-54
    摘要  34
    引言  34-35
    1、材料与方法  35-41
      1.1 试验设计  35
      1.2 试验动物  35
      1.3 大鼠饲养管理  35
      1.4 试验日粮及组成  35-37
      1.5 主要试剂和仪器  37
      1.6 样品采集与处理  37
      1.7 测定指标与方法  37-41
      1.8 数据统计分析  41
    2、结果与分析  41-49
      2.1 日粮能量来源对大鼠生长性能的影响  41-42
      2.2 日粮能量来源对大鼠血清代谢底物的影响  42
      2.3 日粮能量来源对大鼠代谢激素的影响  42-43
      2.4 日粮能量来源对大鼠生殖激素的影响  43
      2.5 日粮能量来源对大鼠下丘脑ARC核初情启动相关基因表达的影响  43-45
      2.6 日粮能量来源对大鼠AVPV初情启动相关基因表达的影响  45-47
      2.7 日粮来源对大鼠垂体初情启动相关基因表达的影响  47-48
      2.8 日粮能量来源对大鼠卵巢初情启动相关基因表达的影响  48-49
    3、讨论  49-52
      3.1 日粮能量来源对大鼠初情启动的影响  49-50
      3.2 日粮能量来源对大鼠血清代谢底物、代谢激素的影响  50
      3.3 日粮能量来源对大鼠生殖激素及初情启动的影响  50-51
      3.4 日粮能量来源对KISS1在下丘脑的表达的影响  51-52
      3.5 日粮能量来源对KISS1基因在卵巢和垂体表达的影响  52
    4、小结  52-54
  试验二、体外培养ARC神经元中INSULIN对KISS1/GPR54表达的影响研究  54-71
    摘要  54
    引言  54-55
    1、材料与方法  55-61
      1.1 试验动物  55
      1.2 动物饲养管理  55
      1.3 试验设计  55-56
      1.4 主要试剂和仪器  56
      1.5 神经细胞培养基配方  56-58
      1.6 原代ARC分离和培养  58-59
      1.7 检测指标及方法  59-61
      1.8 数据统计分析  61
    2、结果与分析  61-68
      2.1 ARC神经元的元代培养  61-63
      2.2 细胞形态观察  63
      2.3 Insulin浓度处理对ARC神经元细胞KISS1基因表达的影响  63-64
      2.4 Insulin浓度处理对ARC神经元初情启动相关基因表达的影响  64-65
      2.5 Insulin浓度处理对ARC神经元细胞GnRH激素分泌的影响  65
      2.6 Insulin时间处理对ARC神经元细胞初情启动相关基因表达和GnRH激素分泌的影响  65-68
    3、讨论  68-70
      3.1 ARC原代神经元细胞培养  68-69
      3.2 ARC神经元细胞中Insulin对KISS1、GnRH表达的影响  69-70
    4、小结  70-71
  试验三、体外培养ARC神经元中LEPTIN对KISS1/GPR54表达的影响研究  71-81
    摘要  71
    引言  71-72
    1、材料与方法  72-73
      1.1 试验动物  72
      1.2 动物饲养管理  72
      1.3 试验设计  72
      1.4 主要试剂和仪器  72
      1.5 原代ARC分离和培养  72-73
      1.6 检测指标及方法  73
      1.7 数据统计分析  73
    2、结果与分析  73-79
      2.1 细胞形态观察  73-74
      2.2 Leptin浓度处理对ARC神经元细胞KISS1基因表达的影响  74
      2.3 Leptin浓度处理对ARC神经元细胞初情启动相关因表达的影响  74-76
      2.4 Leptin浓度处理对ARC神经元细胞GnRH激素分泌的影响  76
      2.5 Leptin时间处理对ARC神经元细胞初情启动相关因表达和GnRH激素分泌的影响  76-79
    3、讨论  79-80
    4、小结  80-81
  试验四、LEPTIN调控KISSPEPTIN/GPR54的细胞内信号途径研究  81-93
    摘要  81
    引言  81-82
    1、材料与方法  82-86
      1.1 试验动物  82
      1.2 试验设计  82
      1.3 神经细胞培养基配方  82
      1.4 原代下丘脑神经细胞培养  82
      1.5 主要仪器设备和试剂  82-83
      1.6 观测指标及测定方法  83-86
      1.7 数据统计分析  86
    2、结果与分析  86-91
      2.1 细胞形态观察  86
      2.2 不同AG490剂量处理对ARC神经元细胞JAK2蛋白表达的影响  86-87
      2.3 Leptin和AG490处理对ARC神经元细胞pJAK2、pSTAT3、kisspeptin蛋白表达影响  87-89
      2.4 Leptin和AG490处理对ARC神经元KISS1、OB-Rb基因表达的影响  89-90
      2.5 Leptin和AG490处理对ARC神经元细胞GnRH激素分泌的影响  90-91
    3、讨论  91-92
    4、小结  92-93
五、总体讨论  93-95
六、全文总体结论、创新点  95-96
  1、全文总体结论  95
  2、创新点  95-96
参考文献  96-108
附录1：REAL-TIME PCR标准曲线及溶解曲线  108-112
附录2：激素放射免疫分析药盒标准曲线  112-114
附录3：LEPTIN PATHWAY分析图  114-115
致谢  115-116
攻读博士学位期间发表的学术论文  116

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 狩猎、野生动物驯养 > 各种野生动物驯养 > 实验用动物
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