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花生Cu/Zn-SOD基因分子特征及其表达差异分析

作　者: 张秀荣
导　师: 万勇善
学　校: 山东农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 花生 Cu/Zn-SOD 基因克隆分子特征表达分析
分类号: S565.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

花生是世界四大油料作物之一，也是我国最重要的油料和经济作物之一。干旱严重影响花生的产量和质量，是我国花生生产的首要限制因子。因此，研究花生不同品种的抗旱机理，对加快花生抗旱育种进程意义重大。SOD是抗氧化防护系统的关健酶，在抵御或减轻干旱导致的氧化胁迫伤害过程中发挥关键作用。本研究利用RT-PCR结合以基因组DNA为模板的PCR扩增方法，分离了花生栽培品种和二倍体野生种细胞质Cu/Zn-SOD基因（AhCSD1）和叶绿体Cu/Zn-SOD基因（AhCSD2）；通过序列比对分析，从分子进化角度探讨了花生栽培种AhCSD1和AhCSD2的分子起源；对PEG胁迫和干旱胁迫下AhCSD2的表达模式以及品种间的差异进行了分析。主要研究结果如下：（1）花生AhCSD1的克隆及序列分析栽培品种山花9号AhCSD1两条cDNA序列rShCSD1-1和rShCSD1-2，同源性98.18％，开放阅读框内存在10个SNP位点；对应核DNA序列gShCSD1-1与gShCSD1-2，同源性97.08%，共存在64个差异位点，其中有27个SNP，两条序列具有3个限制性酶识别位点的差异；AhCSD1含有8个外显子和7个内含子。4个栽培品种rCSD1-2序列完全一致，rCSD1-1序列同源性99.68%，编码区存在6个SNP位点，对应氨基酸序列的第53、75、147位存在差异。分子进化分析显示gShCSD1-1与gShCSD1-2分别来自栽培种的A、B两个染色体组；B组野生种A. ipaensis为栽培种花生B染色体组供体；A染色体组野生种A. duranensis与栽培种花生分子亲缘关系比A. kuhlmannii更近。（2）花生AhCSD2的克隆及序列分析从栽培品种山花11号获得AhCSD2两条cDNA序列rCSD2-1与rCSD2-2，序列全长764bp，开放阅读框为624bp，两序列同源性98.56％，存在11个SNP；对应核DNA序列gSh11CSD2-1与gSh11CSD2-2长度分别是2395bp与2428bp，同源性96.54%，具有84个差异位点，其中46个SNP，存在5个限制性酶的识别位点的差异；AhCSD2含有8个外显子和7个内含子。推导的氨基酸序列AhCSD2-1和AhCSD2-2同源性为96.14%，长度均为207aa；预测叶绿体转位肽为1~53aa，且两序列在此区域有6个氨基酸残基差异；两条序列在成熟肽区域的2个氨基酸残基的差异可能导致蛋白质空间结构的变异。11个栽培品种间gCSD2-2序列一致，gCSD2-1序列同源性为99.98%，内含子区存在3个SNP；AhCSD2分子进化分析显示gCSD2-1和gCSD2-2分别来自栽培种花生A、B两个染色体组；A. ipaensis为栽培种花生B染色体组供体。A组野生种A. cardenasii与栽培种花生分子亲缘关系最近，其次是A. duranensis。（3）PEG胁迫下花生AhCSD2在品种间的表达差异分析PEG胁迫下不同抗旱性品种叶片SOD活性及AhCSD2基因转录水平表达量差异极显著（p<0.01）；抗旱品种山花11号和冀花4号AhCSD2转录水平表达量和SOD活性极显著高于不抗旱品种白沙1016和Krapt.st.16；AhCSD2转录水平和SOD活性分别于处理12h和24h时达到峰值，且呈极显著正相关（r>0.95，p<0.01）；结果表明花生SOD活性受AhCSD2基因转录水平的调控。（4）干旱胁迫下不同品种AhCSD2转录水平表达量的分析品种间SOD活性与AhCSD2转录水平的表达量呈极显著正相关；干旱胁迫下AhCSD2转录水平的表达量与品种抗旱性呈极显著正相关，AhCSD2转录水平的表达量可作为品种抗旱性机制的鉴定评价指标。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-24
  1.1 作物的抗旱机制研究  14-17
    1.1.1 渗透调节机制  14
    1.1.2 干旱胁迫诱导蛋白的研究  14-15
    1.1.3 干旱胁迫信号转导机制  15-17
  1.2 植物抗氧化防护系统的研究  17-21
    1.2.1 活性氧的产生及危害  17-18
    1.2.2 抗氧化保护酶类研究进展  18-19
    1.2.3 非酶类抗氧化物质研究进展  19
    1.2.4 抗氧化酶相关基因研究进展  19-21
  1.3 花生抗旱性与 SOD 研究  21-22
  1.4 花生野生种质资源的利用  22-23
    1.4.1 花生属植物的分类  22-23
    1.4.2 花生栽培种与二倍体野生种进化关系研究  23
  1.5 本研究的目的意义  23-24
2 材料与方法  24-39
  2.1 花生 Cu/Zn-SOD 基因 AhCSD1 和 AhCSD2 的克隆试验  24-33
    2.1.1 材料  24-25
      2.1.1.1 植物材料  24-25
      2.1.1.2 主要试剂  25
    2.1.2 方法  25-33
      2.1.2.1 花生 AhCSD1 和 AhCSD2 PCR 扩增引物的设计  25
      2.1.2.2 花生叶片总 RNA 的提取与检测  25-27
      2.1.2.3 RNA 的反转录  27
      2.1.2.4 花生 AhCSD1 和 AhCSD2 的 RT-PCR 扩增  27-28
      2.1.2.5 花生叶片基因组 DNA 的提取  28-29
      2.1.2.6 以 DNA 为模板 PCR 扩增花生 AhCSD1 和 AhCSD2  29-30
      2.1.2.7 目的基因的胶回收  30-31
      2.1.2.8 目的片段与 pEASY-T1 载体连接并转化大肠杆菌  31-32
      2.1.2.9 阳性重组子的鉴定和测序  32
      2.1.2.10 序列的生物信息学分析  32-33
  2.2 PEG 胁迫下花生 AhCSD2 的表达模式探究试验  33-36
    2.2.1 材料  33
      2.2.1.1 植物材料  33
      2.2.1.2 仪器试剂  33
    2.2.2 方法  33-36
      2.2.2.1 材料处理与取样  33
      2.2.2.2 SOD 活性测定  33-34
      2.2.2.3 不同品种功能叶总 RNA 的提取与反转录  34
      2.2.2.4 荧光定量 PCR 引物的设计  34
      2.2.2.5 Real-Time PCR 扩增体系的优化  34-35
      2.2.2.6 AhCSD2 基因 mRNA 相对表达量计算方法  35-36
      2.2.2.7 数据处理分析  36
  2.3 干旱胁迫下种质资源 SOD 活性与 AhCSD2 转录水平的表达量鉴定试验  36-39
    2.3.1 材料  36-37
      2.3.1.1 植物材料  36-37
      2.3.1.2 仪器试剂  37
    2.3.2 方法  37-39
      2.3.2.1 材料种植与处理  37
      2.3.2.2 SOD 活性与 AhCSD2 转录水平的表达量测定  37
      2.3.2.3 SOD 活性与 AhCSD2 转录水平的表达量评价  37
      2.3.2.4 品种的抗旱性鉴定  37-38
      2.3.2.5 数据处理分析  38-39
3 结果与分析  39-70
  3.1 花生 AhCSD1 的克隆及核苷酸序列多态性分析  39-47
    3.1.1 花生叶片总 RNA 的提取与 cDNA 第一条链的合成  39
    3.1.2 花生 AhCSD1 的克隆及测序  39-41
    3.1.3 山花 9 号 AhCSD1 序列分析  41-45
      3.1.3.1 cDNA 序列分析  41
      3.1.3.2 DNA 序列分析  41-43
      3.1.3.3 推导的氨基酸序列分析  43-45
    3.1.4 栽培品种 AhCSD1 等位基因差异及氨基酸序列分析  45-46
    3.1.5 花生栽培种与野生种 AhCSD1 核苷酸序列分析  46-47
    3.1.6 花生 AhCSD1 与其他植物细胞质 Cu/Zn-SOD 序列比对分析  47
  3.2 花生 AhCSD2 的克隆及序列分析  47-62
    3.2.1 AhCSD2 的电子克隆  47-48
    3.2.2 AhCSD2 的克隆及测序  48-50
    3.2.3 山花 11 号 AhCSD2 序列分析  50-53
      3.2.3.1 cDNA 序列分析  50
      3.2.3.2 DNA 序列分析  50-53
    3.2.4 栽培品种 AhCSD2 等位基因差异分析  53-54
    3.2.5 花生栽培种与野生种 AhCSD2 核苷酸序列分析  54-55
    3.2.6 花生 AhCSD2 推导的氨基酸序列分析  55-62
      3.2.6.1 亚细胞定位预测分析  55-57
      3.2.6.2 基本理化性质预测分析  57
      3.2.6.3 二级结构预测分析  57-58
      3.2.6.4 三维结构预测分析  58-60
      3.2.6.5 花生与其它植物叶绿体 Cu/Zn-SOD 序列比对分析  60-62
  3.3 PEG 胁迫下不同品种 AhCSD2 基因表达差异分析  62-65
    3.3.1 荧光定量 PCR 引物的检测  62-63
    3.3.2 AhCSD2 转录水平的表达量与 SOD 活性的相关分析  63-65
      3.3.2.1 AhCSD2 mRNA 相对表达水平差异分析  63-64
      3.3.2.2 SOD 活性的差异分析  64-65
      3.3.2.3 AhCSD2 转录水平的表达量与 SOD 活性的相关分析  65
  3.4 干旱胁迫下不同品种 SOD 活性与 AhCSD2 转录水平的表达量分析  65-70
    3.4.1 品种间 SOD 活性差异分析  65-66
    3.4.2 品种间 AhCSD2 转录水平的表达量的差异分析  66-67
    3.4.3 品种抗旱性鉴定分析  67
    3.4.4 SOD 活性和 AhCSD2 转录水平的表达量与品种抗旱性的相关分析  67-70
4 讨论  70-73
  4.1 花生区组 AhCSD1 与 AhCSD2 分子进化关系的探讨  70
  4.2 花生两条 AhCSD2 同源序列分析  70-71
  4.3 花生不同品种 SOD 活性差异机理  71
  4.4 花生 AhCSD2 转录水平的表达量与品种抗旱性的关系探讨  71-73
5 结论  73-74
参考文献  74-80
附录常用试剂溶液配方  80-82
致谢  82-83
攻读学位期间发表论文情况  83

花生Cu/Zn-SOD基因分子特征及其表达差异分析

内容摘要

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