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萝卜耐热性鉴定与热激蛋白基因克隆

作　者: 吴斌
导　师: 柳李旺
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 萝卜耐热鉴定热激蛋白基因克隆表达特征分析
分类号: S631.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

萝卜(Raphanus sativus L.)是十字花科萝卜属重要的蔬菜作物。高温是萝卜夏季生产和供应的主要障碍；选育耐热性强的品种,是实现萝卜周年供应的重要途径。种质材料耐热性鉴定是萝卜耐热育种的基础,目前快速鉴定萝卜耐热性的技术体系尚未建立；萝卜耐热性的生理机制、分子机制方面的研究鲜有报道。本研究采用田间和室内鉴定相结合的方法,探索萝卜耐热性快速鉴定方法,并对萝卜幼苗高温下的生理响应机制、热激蛋白进行研究,以期为萝卜耐热性品种鉴定、抗热新品种选育提供理论依据和技术支撑。主要结果如下：应用田间直接鉴定和人工气候模拟直接鉴定法,对40份萝卜材料的耐热性进行综合鉴定。观察田间高温下萝卜破肚后肉质根膨大速率和播种后54d的单根重,评价萝卜材料的耐热性。鉴定出强耐热白萝卜材料10个,中等耐热性材料3个,不耐热性材料2个；强耐热红萝卜材料7个,中等耐热性材料4个,不耐热材料5个。两个绿皮品种皆为不耐热材料。在室内人工高温模拟条件下,以田间鉴定得到的不同耐热性萝卜品种为材料,观察萝卜幼苗的叶片伤害程度和致死高温处理后萝卜幼苗存活率。结果显示,田间鉴定为强耐热的萝卜材料的热害指数显著低于不耐热材料；36℃处理6d的萝卜幼苗热害指数能有效区分不同萝卜品种的耐热性；53℃高温处理2h后幼苗存活率分析显示,田间耐热性强的萝卜热害后恢复能力强。综合应用热害指数和热害后恢复能力两个指标,可以快速有效地鉴定不同萝卜品种的耐热性。利用耐热性差异显著的萝卜自交系为材料,研究了高温(38℃)胁迫下幼苗丙二醛(MDA)、游离脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量变化与耐热性的关系。结果显示,高温处理前耐热自交系中可溶性蛋白含量高于不耐热材料；可溶性糖、游离脯氨酸和MDA含量无显著差异。处理24h、48h和72h耐热材料中可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸含量均显著高于不耐热材料,MDA含量显著低于不耐热材料。供试材料处理24h四个指标的含量都比处理前显著增加,可溶性蛋白含量在处理48h和72h时逐渐降低,但耐热材料中含量下降得较慢。与处理24h相比,处理48h和72h的可溶性糖、脯氨酸和MDA含量在耐热材料中没有显著变化,而在不耐热材料中处理48h显著高于处理24h时的含量。表明这四个指标的含量变化能准确反映萝卜幼苗耐热性差异,可用于耐热性鉴定评价。根据豌豆热激蛋白HSP17.7的mRNA搜索萝卜EST,根据EST拼接结果设计特异引物,扩增克隆得到了萝卜小分子量HSP17.7序列。NCBI比对结果显示,萝卜HSP17.7序列与芜菁HSP17.6序列的同源性很高。获得的HSP17.7基因的开放阅读框(ORF)长为468bp,终止密码子为TGA,编码155个氨基酸；ExPASy数据库的预测和分析,相对分子量(Mw)为17.7kD,推测其等电点为7.33.表达特征分析显示,HSP17.7基因在高温处理前没有表达,在40℃高温处理1h后开始大量表达,表明HSP17.7基因的表达需要特定条件的诱导。以拟南芥HSP70-3的DNA序列为模板,设计特异引物扩增得到了3条HSP70的序列片段,其中HSP70-1A和HSP70-1B由同一对特异引物扩增得到,可能属于HSP70家族中的不同成员。NCBI比对结果显示三条序列都与拟南芥等十字花科作物的HSP70基因有很高的同源性。利用RAPD.ISSR和SRAP三种分子标记对我国耐热萝卜主要品种进行鉴定,分析了品种间的遗传多样性。共产生210条多态性带,多态率为63.06%,利用SRAP标记的EM1-1/ME4和EM16-1/ME3引物可以鉴别全部材料。遗传相似系数分析表明各耐热萝卜品种间的亲缘关系比较近,遗传背景比较狭窄。聚类分析结果表明,品种间的亲缘关系与皮色、根型、耐热性和地域等因素有关。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略词表 11-12引言 12-14第一章文献综述 14-24 1 作物耐热性鉴定方法 14-18 1.1 外部形态及经济性状指标 14 1.2 微观结构指标 14-15 1.2.1 显微结构指标 14-15 1.2.2 超微结构指标 15 1.3 生理生化机制 15-18 1.3.1 膜的热稳定性 15-16 1.3.2 叶绿素含量及叶绿素荧光 16 1.3.3 可溶性蛋白、丙二醛、脯氨酸及可溶性糖含量 16-17 1.3.4 SOD、CAT、POD酶活性 17 1.3.5 蒸腾率、ATP含量及其他 17-18 1.3.6 高温逆境下植物光合作用及呼吸作用的变化 18 1.4 分子生物学机制 18 2 植物热激蛋白 18-24 2.1 植物热激蛋白的产生与类型 19 2.2 热激蛋白存在与定位 19 2.3 热激蛋白的特点 19-20 2.4 热激蛋白的功能 20-22 2.4.1 植物Hsps分子伴侣作用 20 2.4.2 Hsps与值物的抗热性 20-21 2.4.3 Hsps对植物止常的生长、发育的作用 21 2.4.4 Hsps与植物的抗冷性 21-22 2.4.5 Hsps的交义保护功能 22 2.4.6 Hsps的调节功能 22 2.5 植物Hsps基因表达的调控 22-24第二章萝卜耐热性鉴定方法研究 24-32 1 试验材料与方法 25-26 1.1. 材料 25 1.2 试验方法 25-26 1.2.1 田间直接鉴定 25 1.2.2 苗期气候模拟鉴定 25-26 2 结果与分析 26-30 2.1 田间耐热性鉴定 26-29 2.1.1 肉质根膨大情况分析 26 2.1.2 单根重和不同品种耐热性分析 26-29 2.2 苗期人工气候模拟鉴定 29-30 2.2.1 热害指数统计 29-30 2.2.2 热害后的幼苗存活率 30 3 讨论 30-32第三章高温胁迫下不同耐热性萝卜幼苗生理响应分析 32-36 1 材料与方法 32-33 1.1 供试材料 33 1.2 试验方法 33 1.2.1 处理与取样 33 1.2.2 生化指标含量测定 33 2 实验结果 33-35 2.1 高温胁迫下可溶性蛋白含量变化 33 2.2 高温胁迫下游离脯氨酸含量变化 33-34 2.3 高温胁迫下可溶性糖含量变化 34-35 2.4 高温胁迫下MDA含量变化 35 3 讨论 35-36第四章萝卜热激蛋白基因克隆与表达分析 36-48 1 材料与方法 37-41 1.1 植物材料 37 1.2 方法 37-38 1.2.1 基因组DNA提取 37 1.2.2 引物设计 37-38 1.2.3 热激蛋白基因的特异扩增 38 1.2.4 PCR产物的检测 38 1.3 热激蛋白基因克隆与分析 38-40 1.3.1 热激蛋白基因的特异性扩增 38 1.3.2 目的片段的回收 38 1.3.3 大肠杆菌感受态的制备 38-39 1.3.3 重组质粒的构建 39 1.3.4 重组质粒的转化 39 1.3.5 质粒的提取及重组质粒的鉴定 39-40 1.3.6 序列测定及分析 40 1.4 HSP17.7表达分析 40-41 1.4.1 总RNA的提取 40 1.4.2. RNA纯化 40-41 1.4.3 RNA检测 41 1.4.4 RNA反转录 41 1.4.5 HSP17.7表达特征分析 41 2 结果与分析 41-45 2.1 扩增和克隆结果 42 2.2 HSP70片段的核苷酸序列分析 42-43 2.3 萝卜HSP17.7基因核苷酸序列和氨基酸序列分析 43-45 2.4 萝卜HSP17.7基因表达分析 45 3 讨论 45-48第五章耐热萝卜主要品种鉴定的分子标记分析 48-55 1 材料与方法 49-51 1.1 材料 49 1.2 方法 49-51 1.2.1 田间鉴定 49 1.2.2 基因组DNA的提取和纯化 49 1.2.3 PCR反应体系 49 1.2.4 数据处理与分析 49-51 2 结果与分析 51-53 2.1 遗传多样性分析 51 2.2 遗传相似性分析 51-52 2.3 指纹图谱分析与品种鉴别 52 2.4 聚类分析 52-53 3 讨论 53-55全文结论 55-56参考文献 56-62发表论文情况 62-63致谢 63

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