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基于RNA干扰的灰飞虱干扰致死基因及抗水稻条纹病毒基因的筛选与验证

作　者: 陈爱玲
导　师: 李飞
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 灰飞虱 RSV 内参基因 RNAi
分类号: S435.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

灰飞虱(Laodelphax striatellus)是我国粮食生产上的重要害虫,它不仅可以刺吸植株汁液,造成直接危害,同时还能传播水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病等多种病毒病,造成病害流行。水稻条纹叶枯病是由灰飞虱携带的水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起的重要病毒病,是灰飞虱造成大规模危害的主要原因。2000年以来,伴随着我国江淮稻区灰飞虱种群的逐年增长,水稻条纹叶枯病发生日益严重。灰飞虱防控以化学药剂为主,但长期单一用药极易导致害虫产生抗药性；而对于灰飞虱传播的水稻条纹病毒,目前仍以“治虫控病”为主,尚无有效药剂。RNA干扰(RNAi)技术是近年来研究应用的热点,除了应用于基因功能研究,还可以通过沉默靶标基因干扰特定生命过程,从而达到致死的效果。因此,筛选具有专一性且高效致死的RNAi靶基因,同时完善RNAi技术在实际生产中的应用,将有可能为病虫害防控开辟新途径。本研究主要通过RNA干扰技术筛选高效灰飞虱干扰致死基因及RSV病毒抑制基因,为培育转基因抗虫抗病水稻提供前期工作基础。主要研究结果如下：1、首先使用NormFinder、qBasePlus和BestKeeper三个软件分析EF、Actin、ARF、 GAPDH和β-tubulin5个内参的表达稳定性。NormFinder软件分析得到基因稳定性为EF=Actin> ARF> GAPDH>β-tubulin, qBasePlus软件分析得到结果为EF> Actin> ARF> GAPDH> p-tubulin,而BestKeeper软件分析得到结果为Actin基因稳定性最好,EF基因次之,β-tubulin稳定性最差。综合三个软件的分析结果,灰飞虱EF、Actin基因最为稳定,可作为实时荧光定量PCR实验中的内参基因。2、将dsRNA喂食二龄灰飞虱若虫,120h后检测14个灰飞虱基因的dsRNA对飞虱若虫的致死效果,筛选出几丁质酶、α-微管蛋白、核糖体蛋白L9-B、γ-微管蛋白、泛素缀合酶、p-微管蛋白等6个具有高致死效果的基因,其处理120h后平均校正死亡率均在50%以上,其中几丁质酶基因dsRNA浓度最低,但致死效果最好,校正死亡率达到62%,为灰飞虱最优干扰致死基因。3、用3种dsRNA分别喂食携带RSV病毒的2龄灰飞虱,96h后利用荧光定量PCR技术检测灰飞虱体内RSV病毒的表达量。结果表明,RSV病毒基因组中的NSvc4、CP基因表达量大幅下调95%以上,RdRp基因下调幅度为51%～78%。同时,测定了特异性dsRNA喂食对RSV病毒基因组中其他基因表达量的影响,初步发现特异性dsRNA处理对其他RSV基因的表达具有一定的下调作用,表明dsRNA能够导致病毒转录本丰度的下降。本研究为利用转dsRNA工程微生物或转基因水稻进行RSV病毒的防治提供了重要依据。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章文献综述  12-26
  1. 灰飞虱的概况  12-17
    1.1 灰飞虱的形态特征  12-13
    1.2 灰飞虱的发生规律和为害特点  13-14
    1.3 灰飞虱大发生的原因  14-15
    1.4 灰飞虱的防治策略及其研究动态  15-17
  2. 水稻条纹病毒的概况  17-20
    2.1 RSV病毒粒体形态  17
    2.2 RSV的基因组结构与功能  17-18
    2.3 RSV与灰飞虱亲和性互作  18-19
    2.4 RSV的防治策略及其研究动态  19-20
  3. RNA干扰技术的研究及应用  20-23
    3.1 RNA干扰的定义  20
    3.2 RNA干扰的分子机理  20-21
    3.3 RNA干扰技术研究进展  21-23
  4. 本研究的目的和意义  23-24
  5. 研究内容及技术路线  24-26
第二章灰飞虱内参基因的选择  26-36
  摘要  26
  1. 材料与方法  26-31
    1.1 供试昆虫  26-27
    1.2 主要仪器和试剂  27
    1.3 持家基因的表达稳定性实验  27-31
  2. 结果与分析  31-35
    2.1 RNA样品的质量验证  31
    2.2 引物扩增效率及特异性验证  31-33
    2.3 持家基因的稳定性分析  33-35
  3. 讨论  35-36
第三章灰飞虱致死基因的筛选及验证  36-44
  摘要  36-37
  1. 材料和方法  37-41
    1.1 供试昆虫  37
    1.2 主要仪器和试剂  37
    1.3 总RNA提取和cDNA合成  37
    1.4 dsRNA合成  37-40
    1.5 dsRNA喂食实验  40-41
  2. 结果与分析  41-42
  3. 讨论  42-44
第四章抗条纹叶枯病DSRNA的筛选及验证  44-58
  摘要  44-45
  1. 材料和方法  45-50
    1.1 供试昆虫  45
    1.2 主要试剂和仪器  45
    1.3 ELISA筛选  45-46
    1.4 引物设计  46
    1.5 分子克隆  46-48
    1.6 dsRNA合成  48-49
    1.7 dsRNA喂食实验  49
    1.8 病毒基因表达量的qRT-PCR测定  49-50
  2. 结果与分析  50-56
    2.1 带毒灰飞虱ELISA筛选  50
    2.2 dsRNA序列分析  50-53
    2.3 荧光定量PCR产物熔解曲线分析及扩增效率的一致性分析  53-54
    2.4 RNA干扰后靶标基因mRNA的qRT-PCR检测  54-56
  3. 讨论  56-58
全文总结  58-60
参考文献  60-68
附录：攻读硕士学位期间学术论文的发表情况  68-70
致谢  70

基于RNA干扰的灰飞虱干扰致死基因及抗水稻条纹病毒基因的筛选与验证

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