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斜纹夜蛾抗真菌肽基因gallerimycin的克隆及功能研究

作　者: 张雯迪
导　师: 王中康
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 抗真菌肽 gallerimycin RNAi 斜纹夜蛾 RT-qPCR
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Gallerimycin基因是鳞翅目昆虫中的一种抗真菌肽,它可以被多种细菌、真菌甚至金属蛋白酶诱导,在脂肪体中合成,然后分泌到血淋巴中起作用。Gallerimycin主要对丝状真菌有明显活性,对细菌和酵母没有抗性,在昆虫体液免疫中起重要作用。斜纹夜蛾是一种鳞翅目蔬菜害虫,其幼虫不仅食性杂,而且老熟幼虫会形成暴食,对多种蔬菜都有危害。目前防治斜纹夜蛾幼虫的主要化学方法仍然是使用化学农药。化学农药作为杀虫剂的主要危害是污染环境;容易使害虫产生抗药性;容易残留在蔬菜上危害人类健康。随着人们的环保意识的提高,以及对生活品质要求的提高,化学杀虫剂的危害逐渐显现并引起人们的重视。因此莱氏野村菌等虫生真菌的研究和生防应用得到越来越多的关注。本研究通过比对GenBank中gallerimycin的蛋白质序列,找出gallerimycin氨基酸的保守序列,设计简并引物,PCR扩增其保守区序列;以gallerimycin基因的保守区序列作为依据,设计特异性引物,采用3’RACE和5’RACE扩增斜纹夜蛾老熟幼虫gallerimycin基因的全长cDNA序列;在获得gallerimycin基因全长cDNA的基础上,通过表达谱分析和RNA干扰研究gallerimycin的基因功能。斜纹夜蛾老熟幼虫gallerimycin基因的功能研究,有助于从分子水平上阐明斜纹夜蛾gallerimycin基因在体液免疫中的分子生物学机制,这对于研发新型生物杀虫剂有重要的指导意义。1.斜纹夜蛾gallerimycin基因的克隆以被莱氏野村菌CQNr01侵染的斜纹夜蛾老熟幼虫的cDNA作为模板,根据gallerimycin保守序列设计的简并引物,通过PCR获得一个86bp的基因片段。通过NCBI BLAST进行生物学信息分析,结果表明该片段的基因序列和草地贪夜蛾(Spdoptera frugiperda)有91%的相似性。在斜纹夜蛾gallerimycin基因保守区序列的基础上,设计基因特异性引物,用3’RACE和5’RACE技术扩增得到gallerimycin基因的全长cDNA序列, GenBank登录号为HM747937。克隆得到的斜纹夜蛾gallerimycin基因cDNA序列长380bp,开放阅读框长225bp,共编码75个氨基酸,5’端和3’端非编码区分别长22bp和133bp。该基因编码的蛋白质8.1KDa,等电点8.79,具有一个由20个氨基酸组成的信号肽。进化树分析和氨基酸序列比对表明,该基因编码的产物属于gallerimycin。其一级结构具有gallerimycin的共同特点:具有6个半胱氨酸残基,形成3个二硫键。2.斜纹夜蛾gallerimycin基因的表达谱分析通过RT-qPCR测定斜纹夜蛾老熟幼虫被莱氏野村菌侵染后的不同时期,gallerimycin基因的表达情况。结果表明,gallerimycin基因的表达是和侵染时间成线性关系的。gallerimycin的表达量随着侵染时间的推移逐步上升,到24小时达到最大值,随后又逐步降低。3.gallerimycin基因的RNA干扰分析根据gallerimycin基因的编码区设计干扰引物,通过Ambion公司的MEGAscript? High Yield Transcription Kit试剂盒获得还有T7启动子的gallerimycin dsRNA。用微型注射器将dsRNA注射入斜纹夜蛾老熟幼虫的腹腔。通过real-time PCR分析,干扰效率为73%,通过生物测定,发现gallerimycin基因被干扰的斜纹夜蛾老熟幼虫的抗真菌能力下降。本研究表明gallerimycin基因和斜纹夜蛾抗真菌能力有直接关系且起到重要作用。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-9
1 绪论  9-23
  1.1 研究背景及意义  9-10
  1.2 昆虫抗菌肽研究进展  10-17
    1.2.1 昆虫抗真菌肽的类型  10-14
    1.2.2 抗真菌肽的分子调控机制  14-15
    1.2.3 抗真菌肽的作用机制  15
    1.2.4 转基因技术在昆虫抗真菌肽研究中的应用  15-16
    1.2.5 RNAi 在昆虫抗真菌肽研究中的应用  16-17
  1.3 gallerimycin 基因的研究进展  17-19
  1.4 主要研究目标和研究内容  19-20
    1.4.1 主要研究目标  19
    1.4.2 整体思路  19-20
  1.5 主要研究内容和技术路线  20-22
    1.5.1 斜纹夜蛾抗真菌肽基因gallerimycin 的克隆及序列分析  20
    1.5.2 实时荧光定量PCR 检测斜纹夜蛾gallerimycin 的表达情况  20-21
    1.5.3 斜纹夜蛾gallerimycin 基因RNA 干扰  21-22
  1.6 本研究的创新性  22-23
2 材料和方法  23-36
  2.1 实验材料  23-24
    2.1.1 实验供虫  23
    2.1.2 实验菌种  23
    2.1.3 主要仪器  23
    2.1.4 主要试剂  23-24
  2.2 培养基  24
  2.3 供试菌株培养和孢子悬浮液的制备  24
  2.4 斜纹夜蛾gallerimycin 基因的克隆  24-36
    2.4.1 兼并引物获得一段cDNA 序列  24-27
    2.4.2 3’RACE 和5’RACE 克隆gallerimycin3’端和5’端cDNA 序列  27-31
    2.4.3 RT-qPCR 检测被莱氏野村菌侵染后的斜纹夜蛾老熟幼虫脂肪体中gallerimycin 的表达情况  31-33
    2.4.4 斜纹夜蛾幼虫gallerimycin 基因的RNAi  33-34
    2.4.5 RNA 干扰效果检测  34-36
3 结果与分析  36-48
  3.1 斜纹夜蛾gallerimycin 基因的克隆和分析  36-40
    3.1.1 斜纹夜蛾gallerimycin 基因保守区序列的克隆和分析  36-40
  3.2 斜纹夜蛾gallerimycin 基因的进化分析  40-42
  3.3 斜纹夜蛾gallerimycin 基因的诱导表达  42-45
    3.3.1 引物退火温度的确定  42-44
    3.3.2 标准曲线的绘制  44
    3.3.3 实时荧光定量PCR 检测斜纹夜蛾gallerimycin 的表达谱  44-45
  3.4 RNA 干扰效果检测  45-48
    3.4.1 实时荧光定量PCR 检测gallerimycin dsRNA 干扰效果  45-46
    3.4.2 生物测定RNA 干扰效果  46-48
4 讨论  48-52
  4.1 斜纹夜蛾gallerimycin 基因  48-49
    4.1.1 斜纹夜蛾gallerimycin 基因的克隆  48-49
    4.1.2 斜纹夜蛾gallerimycin 的特点  49
  4.2 斜纹夜蛾脂肪体中gallerimycin 的表达情况  49-50
  4.3 RNAi 在斜纹夜蛾gallerimycin 的应用  50-52
5 结论与展望  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-59
附录  59
  A.攻读硕士学位期间参与的科研项目  59
  B. 作者在攻读学位期间发表的论文目录  59

斜纹夜蛾抗真菌肽基因gallerimycin的克隆及功能研究

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