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HBVprec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建及其对HBV增值的影响

作　者: 王朝莉
导　师: 杨致邦
学　校: 重庆医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 乙型肝炎病毒 shRNA RNAi HbeAg 慢病毒
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的及意义:构建针对乙肝病毒(HBV)前c/c区的短发夹环RNA(shRNA)的慢病毒表达载体质粒(pls),通过pls感染含乙肝病毒的肝癌细胞,观察siRNA对e抗原表达的抑制作用,探讨siRNA对HBV增值的抑制作用,为应用RAN干扰技术治疗HBV感染奠定实验基础。方法:1、采用DNA重组技术等基因工程技术,针对HBV prec/c基因序列设计两对寡核苷酸靶向序列和一对无关序列,并由上海生工化学合成。2、将合成的寡核苷酸与通过限制性内切酶消化的含U6启动子及表达GFP基因的慢病毒表达载体Plentilox3.7连接,转化大肠杆菌DH5α,酶切、测序进行鉴定。3、将重组体与辅助质粒系统共转染293T细胞包装病毒颗粒。4、收集病毒液,感染Hep-G2 2.15细胞,用RT-PCR检测HBVprec/c mRNA转录, MEIA检测细胞裂解液和培养上清中HBeAg的表达水平。结果:1、经酶切、连接、转化、鉴定和基因序列测定证实已成功构建含shRNA的慢病毒表达载体。2、与辅助质粒系统共转染293T细胞,成功组装慢病毒颗粒。3、将病毒液感染Hep-G2 2.15细胞,通过MEIA检测细胞裂解液和培养上清中HBeAg的表达,均有不同程度的抑制。同时提取总RNA,通过RT-PCR证实,两对寡核苷酸靶向序列对HBVprec/c的转录同样存在抑制作用。结论:1、检测结果证实HepG-2.2.15细胞表达HBV抗原、分泌产生HBeAg,并转录HBeAg mRNA,因此可作为使用RNA干扰技术抑制HBV抗原表达作用研究的靶细胞。2、成功构建带U6启动子及表达GFP基因的shRNA慢病毒表达载体Pls,为应用该载体进行体内外RNAi相关研究提供了实验材料。3、观察结果证实通过构建含shRNA慢病毒表达载体与包装质粒成功组装病毒颗粒,通过感染Hep-G2 2.15细胞,能抑制HBeAg的表达,因此可作为RNA干扰研究的靶载体。4、验证在Hep-G2 2.15细胞均可显著抑制HBeAg表达的两对寡核苷酸序列,为将RNA干扰技术用于乙肝治疗的深入研究提供了实验依据。

全文目录

符号说明  5-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-13
第一部分 shRNA 表达载体 Plentilox3.7 的构建与鉴定  13-22
  实验材料  13-14
  实验方法  14-18
  实验结果  18-22
第二部分靶向 HBVprec/c 基因 shRNA 表达载体在 Hep-G2 2.15 细胞中对 HBeAg 表达的抑制作用  22-34
  材料  22-23
  实验方法  23-28
  实验结果  28-34
讨论  34-40
全文小结  40-41
参考文献  41-44
文献综述  44-49
   参考文献  47-49
致谢  49-50
攻读学位期间发表的学术论文  50

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