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RNAi介导抑制MCF-7细胞中VEGF基因表达

作　者: 王立花
导　师: 樊燕蓉
学　校: 南京理工大学
专　业: 化学工程
关键词: MCF-7 RNAi VEGF 细胞增殖 细胞凋亡
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是促血管生长的最关键因子之一,而血管的生成在肿瘤的生长过程中起着至关重要的作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是一种高效地、特异性地抑制目的基因表达的技术,因此利用RNAi技术抑制VEGF基因表达,可以抑制血管的生成,抑制肿瘤细胞的增殖。本实验将构建的三种靶向VEGF的质粒及四种化学合成的siRNA,利用阳离子脂质体转染的方法将其体外转染到人的乳腺癌MCF-7细胞中,应用细胞生物学的方法检测其抑制VEGF基因表达及抑制肿瘤细胞增殖的作用,以期为RNA干扰在肿瘤治疗方面的研究提供有效的实验依据。本论文主要通过以下几个方面对靶向VEGF的质粒及siRNA进行研究：(1)首先通过GFP标记的VEGF高表达质粒(pVEGF—GFP)转染MCF-7细胞,以转染时间、转染试剂浓度比及细胞接种密度为条件进行转染最佳条件的筛选实验；(2)将靶向VEGF的三个pSilencer质粒分别与GFP标记的VEGF高表达质粒依照最佳转染条件进行共转染,利用倒置荧光显微镜观察pSilencer质粒对VEGF基因表达的抑制情况,利用MTT法检测pSilencer质粒对MCF-7细胞增殖的抑制情况；(3)将化学合成的四种siRNA转染MCF-7细胞,分别利用MTT、ELISA、RT-PCR检测siRNA对细胞增殖的抑制、VEGF mRNA的合成及VEGF蛋白表达抑制情况,从四种不同的siRNA中筛选得到抑制效果最好的一种siRNA;(4)将筛选得到抑制效果较好的化学合成的asiRNA21/23进行进一步研究,利用活体细胞在线培养系统、Annexin V-FITC/PI双染色及流式细胞术检测asiRNA21/23对MCF-7细胞的增殖抑制情况及其促凋亡作用。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
1、引言  10-18
  1.1 靶向血管内皮生长因子的肿瘤抗血管生成的基因治疗  10-14
    1.1.1 血管生成在肿瘤生成中的作用及肿瘤血管生成的调节因子  10-11
    1.1.2 VEGF家族及其受体  11-12
    1.1.3 VEGF生物学功能  12-13
    1.1.4 以VEGF及VEGFR为靶点的肿瘤治疗  13-14
  1.2 RNAi及其在肿瘤基因治疗中的应用  14-16
    1.2.1 RNAi的发现  14
    1.2.2 RNAI机制的研究  14-15
    1.2.3 RNAI技术的优势  15
    1.2.4 RNAI在肿瘤治疗中的作用  15-16
    1.2.5 RNAI抑制肿瘤细胞中VEGF基因的表达  16
  1.3 课题的研究背景及研究意义  16-18
    1.3.1 研究背景  17
    1.3.2 研究意义  17-18
2、最佳转染条件的筛选  18-25
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 GFP标记的VEGF高表达质粒转染MCF-7细胞株  18
    2.1.2 实验仪器与试剂  18-19
  2.2 实验方法  19-21
    2.2.1 细胞培养  19-21
    2.2.2 细胞转染条件的筛选  21
  2.3 实验结果与讨论  21-25
    2.3.1 实验结果  22-23
    2.3.2 讨论  23-25
3、靶向VEGF质粒抑制MCF-7细胞增殖  25-32
  3.1 实验材料  25-27
    3.1.1 靶向VEGF质粒DNA及MCF-7细胞株  25-26
    3.1.2 实验仪器与试剂  26-27
  3.2 实验方法  27-28
    3.2.1 细胞培养  27
    3.2.2 荧光显微镜观察质粒抑制VEGF基因表达  27
    3.2.4 MTT法检测共转染质粒DNA抑制MCF-7细胞增殖  27-28
  3.3 实验结果与讨论  28-32
    3.3.1 实验结果  28-31
    3.3.2 讨论  31-32
4、化学合成四种靶向VEGF基因的siRNA抑制MCF-7细胞增殖及VEGF基因表达  32-46
  4.1 实验材料  32-35
    4.1.1 化学合成的靶向VEGF基因的siRNA及MCF-7细胞株  32
    4.1.2 实验仪器与试剂  32-35
  4.2 实验方法  35-41
    4.2.1 细胞培养  35
    4.2.2 MTT检测siRNA抑制MCF-7细胞增殖  35-36
    4.2.3 ELISA检测siRNA抑制MCF-7细胞上清及细胞内VEGF蛋白表达  36-38
    4.2.4 RT-PCR检测siRNA抑制MCF-7细胞VEGF mRNA合成  38-41
  4.3 实验结果与讨论  41-46
    4.3.1 实验结果  41-44
    4.3.2 讨论  44-46
5、asiRNA21/23诱导MCF-7细胞凋亡  46-54
  5.1 实验材料  46
    5.1.1 化学合成的asiRNA21/23及MCF-7细胞株  46
    5.1.2 实验仪器与试剂  46
  5.2 实验方法  46-48
    5.2.1 细胞培养  46
    5.2.2 活体细胞培养系统监测asiRNA21/23抑制MCF-7细胞的增殖  46-47
    5.2.3 ANNEXIN V-FITC/PI双染色检测asiRNA21/23诱导MCF-7细胞凋亡  47-48
    5.2.4 流式细胞术检测asiRNA21/23诱导MCF-7凋亡  48
  5.3 实验结果与讨论  48-54
    5.3.1 实验结果  48-53
    5.3.2 讨论  53-54
6、小结与展望  54-56
  6.1 课题小结  54
  6.2 课题创新性  54
  6.3 课题展望  54-56
致谢  56-57
参考文献  57-62

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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