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胁迫条件下蛋白核小球藻产油过程生理生化及油脂合成关键基因表达规律的研究

作　者: 崔演斌
导　师: 李元广
学　校: 华东理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: 蛋白核小球藻油脂异养-稀释-光诱导营养缺陷生理生化基因转录
分类号: TK6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

微藻能源已成为全球生物能源领域的研究热点,缺氮、缺磷和缺铁等胁迫条件可有效促进微藻细胞内油脂的合成和积累,已成为能源微藻培养过程中调控油脂积累的主要手段。目前文献中对胁迫条件下产油过程生理生化及油脂代谢等方面的认识主要以衣藻等模式藻为主,对可大规模培养的工业藻株在该方面的相关研究少有报道,限制了微藻能源的产业化。笔者所在课题组首创的异养-稀释-光诱导串联培养技术,可在短时间内迅速提高小球藻胞内油脂含量,但目前对该过程的生理生化和关键基因转录变化等认识尚未透彻,因而亟待深入研究。本文以蛋白核小球藻为研究对象,依托课题组前期自主完成的该藻株全基因组信息,针对异养-稀释-光诱导、营养缺陷(缺氮、缺磷和缺铁)等培养过程,分别从生化组分、光合生理以及油脂代谢基因表达等角度出发,系统研究了小球藻在不同产油培养模式下的生理生化变化规律和基因转录规律,以期为系统阐明能源微藻细胞生长及油脂积累与环境互作的响应机制提供一定的实验依据。首先,通过对培养过程中藻细胞的油脂等其他生化成分进行测定,发现光诱导后多种生化成分含量发生剧烈变化,其中总脂和中性脂含量在24小时内分别从异养末期的24.5%和18.0%上升到33.7%和25.9%；营养缺陷下的藻细胞均可积累较高含量的油脂,其中缺氮培养7天后总脂和中性油脂含量分别达到干重的50.32%和34.29%。其次,通过测定叶绿素荧光参数(Fv/Fm和NPQ)、活性氧含量和抗氧化酶活性,发现光诱导培养的初始阶段藻细胞生理参数变化显著,表明强光在培养前期对藻细胞光合作用的恢复有诱导作用,但持续强光照射会抑制藻细胞的光化学活性,并使藻细胞处于生理胁迫状态。MDA含量的持续增加表明缺磷条件下藻细胞受活性氧损伤严重,缺氮藻细胞活性氧的产生和清除处于新的平衡,缺铁对藻细胞内活性氧含量的变化影响不大。最后,对藻细胞中心碳代谢和油脂合成途径中的关键基因的转录水平进行了检测。光诱导培养阶段,中心碳代谢中编码ME的g4297和g6562基因转录丰度分别有近2.5倍和3.5倍的增加；编码DGAT的g3280和g7566基因表达量分别上调了10倍和47倍。在营养缺陷培养中, Rubisco和PEPC编码基因表达有所下调；编码ME、ACCase及DGAT的多个基因在表达量上有较大幅度的提升,其中缺氮对ME、ACCase和DGAT各基因表达诱导作用最强。通过基因表达与油脂含量的相关性分析发现,accD、dgat g3280和me g6562基因是与藻细胞中油脂合成最为相关的基因。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
目录  8-11
第1章绪论  11-23
  1.1 微藻能源研究概况  11
  1.2 小球藻生物学特性及其应用概述  11-12
    1.2.1 小球藻的生物学特性  11-12
    1.2.2 小球藻的应用价值和市场前景  12
  1.3 影响微藻胞内油脂合成积累的方式  12-15
    1.3.1 培养条件对微藻产油的影响  13
    1.3.2 营养成分对微藻产油的影响  13-14
    1.3.3 培养方式对微藻产油的影响  14-15
  1.4 微藻细胞脂质合成途径及基因工程改造研究现状  15-21
    1.4.1 脂肪酸的合成  17-18
    1.4.2 甘油三酯的合成  18
    1.4.3 油体的形成  18
    1.4.4 油脂合成调控关键基因及基因工程改造研究现状  18-21
  1.5 本文研究的目的、意义和主要研究内容  21-23
第2章蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导产油过程生化成分和生理参数变化规律  23-41
  2.1 引言  23
  2.2 材料与方法  23-28
    2.2.1 试剂与仪器  23-24
    2.2.2 藻种和培养条件  24-25
    2.2.3 藻细胞生长曲线测定  25
    2.2.4 藻细胞油脂含量的测定  25-26
    2.2.5 藻细胞色素含量的测定  26-27
    2.2.6 藻细胞蛋白含量的测定  27
    2.2.7 藻细胞碳水化合物含量的测定  27-28
    2.2.8 蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养过程生理参数的测定  28
    2.2.9 数据处理  28
  2.3 结果与讨论  28-39
    2.3.1 异养-稀释-光诱导/光自养过程藻细胞生长及生化成分变化规律  28-33
    2.3.2 异养-稀释-光诱导/光自养过程藻细胞油脂含量变化规律  33-34
    2.3.3 异养-稀释-光诱导/光自养过程藻细胞叶绿素荧光参数的变化规律  34-37
    2.3.4 异养-稀释-光诱导/光自养过程藻细胞活性氧及抗氧化酶活性变化规律  37-39
  2.4 本章小结  39-41
第3章蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导产油过程油脂代谢关键酶基因表达与克隆  41-54
  3.1 引言  41
  3.2 材料与方法  41-46
    3.2.1 试剂与仪器  41-42
    3.2.2 藻种和培养条件  42
    3.2.3 总RNA提取及cDNA第一条链的合成  42-43
    3.2.4 目的基因荧光定量PCR表达量变化的检测  43-44
    3.2.5 靶标基因的克隆及序列验证  44-46
  3.3 结果与讨论  46-52
    3.3.1 异养-稀释-光诱导培养过程ME、PEPC及DGAT各同工酶基因表达变化  46-49
    3.3.2 异养-稀释-光诱导培养过程油脂合成关键基因的表达变化及相关性分析  49
    3.3.3 异养-稀释-光诱导培养过程敏感靶标基因的克隆与分析  49-52
  3.4 本章小结  52-54
第4章蛋白核小球藻营养限制培养产油过程生化成分和生理参数变化规律  54-68
  4.1 引言  54
  4.2 材料与方法  54-57
    4.2.1 试剂与仪器  54-55
    4.2.2 藻种和培养条件  55-56
    4.2.3 藻细胞生长曲线测定  56
    4.2.4 藻液中培养基残余营养成分的测定  56
    4.2.5 藻细胞油脂含量的测定  56
    4.2.6 藻细胞色素含量的测定  56
    4.2.7 蛋白核小球藻营养限制培养过程生理参数的测定  56-57
  4.3 结果与讨论  57-67
    4.3.1 营养元素的利用情况及藻细胞的生长  57-59
    4.3.2 营养限制培养过程藻细胞油脂含量及油脂产率的变化规律  59-61
    4.3.3 营养限制培养过程藻细胞叶绿素荧光参数的变化规律  61-63
    4.3.4 营养限制培养过程藻细胞活性氧及抗氧化酶活性变化规律  63-67
  4.4 本章小结  67-68
第5章蛋白核小球藻营养限制培养油脂代谢关键酶基因表达变化  68-77
  5.1 引言  68
  5.2 材料与方法  68-71
    5.2.1 试剂与仪器  68-69
    5.2.2 藻种和培养条件  69
    5.2.3 总RNA提取及cDNA第一条链的合成  69
    5.2.4 目的基因荧光定量PCR表达量变化的检测  69-70
    5.2.5 数据处理  70-71
  5.3 结果与讨论  71-76
    5.3.1 营养限制培养对中心碳代谢途径的基因表达的影响  71-73
    5.3.2 营养限制培养对油脂合成途径的基因表达的影响  73-75
    5.3.3 油脂合成途径关键基因的表达变化与藻细胞油脂含量的相关性分析  75-76
  5.4 本章小结  76-77
第6章结论与展望  77-79
  6.1 结论  77
  6.2 展望  77-79
参考文献  79-87
攻读学位期间的主要学术成果  87-88
致谢  88

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