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L-精氨酸高产菌种的选育及发酵研究

作　者: 陈晓博
导　师: 张鹏
学　校: 北京化工大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: L-Arg 发酵诱变育种营养缺陷型代谢调控
分类号: TQ922.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

L-精氨酸(L-Arg)是一种半必需碱性氨基酸,是生物体的重要代谢产物,在食品、医药、饲料等行业具有广泛的应用。本文利用物理和化学诱变方法相结合,通过赋予出发菌株结构类似物抗性和氨基酸营养缺陷型选育,获得一株L-Arg产量明显提升的菌株,并对该菌株的发酵条件和代谢调控机制进行了初步的探索。1.培养基的优化：确定了发酵培养基内葡萄糖、硫酸铵、碳酸钙、硫酸镁、磷酸氢二钾的最佳浓度分别为80g/L、25g/L、15g/L、0.5g/L、1g/L,生物素和硫胺素的最佳添加量为80ug/L和160g/L。优化过后的培养基,在相同条件下发酵96h, L-Arg产量为0.71g/L,相比原始菌株提高了31.5%。2.紫外单因子诱变：考察UV单独作用时的致死率,确定诱变条件为40s,经过多批次诱变、结构类似物D-Arg抗性平板筛选和连续传代稳定性测定,获得一株高产菌BC307 (D-Argr),其结构类似物抗性浓度为4g/L, L-Arg产量为2.94g/L。3.硫酸二乙酯单因子诱变：考察DES单独作用时的致死率,确定诱变浓度为1%,经过多批诱变和结构类似物D-Arg抗性平板筛选,所得菌株的产量非但没有明显提高反而有下降,说明硫酸二乙酯单独作用效果很差。3.紫外线和硫酸二乙酯复合诱变：考察复合诱变的致死率,确定诱变条件为：紫外照射10s加硫酸二乙酯浓度1%,经过多批诱变、结构类似物D-Arg抗性平板筛选和传代稳定性测定,获得一株高产菌BC307130315 (D-Argr),其结构类似物抗性提升到6g/L, L-Arg产量为4.48g/L。4.脯氨酸营养缺陷型菌株的选育：BC307130315为出发菌株复合诱变处理,探讨了饥饿培养时间、二氮培养时间,青霉素的添加浓度与处理时间。经过多批次复合诱变、脯氨酸平板筛选和传代稳定性考察获得BC30713031584菌株,其结构类似物抗性为6g/L, L-Arg产量为5.76g/L。5.发酵代谢调控的初步研究：以菌株BC30713031584为目标,对发酵中前体物的添加、碳源和氮源的补加做了初步探索,发现L-谷氨酸(发酵第18小时添加)3g/L、丙二酸(起始添加)3g/L,都能令最终产量有较明显的提高。而葡萄糖和硫酸铵的补加,只能在一定程度上促进发酵,如果添加的过多或者加入时间不正确,会对产酸有较强抑制作用。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章文献综述  12-22
  1.1 L-Arg的理化性质  12
  1.2 L-精氨酸在医药、食品工业中的应用  12-13
  1.3 L-Arg的生产情况及市场需求  13-14
  1.4 L-精氨酸产生菌的选育研究进展  14-16
    1.4.1 传统的诱变育种  14-15
    1.4.2 基因工程育种  15-16
    1.4.3 离子注入育种  16
  1.5 L-Arg的生物合成途径及代谢调控机制  16-18
    1.5.1 L-Arg的代谢控制育种策略  17-18
    1.5.2 解除菌体自身的反馈调节  18
    1.5.3 增加前体物的合成  18
    1.5.4 阻断进一步向下的代谢途径  18
  1.6 L-精氨酸的检测方法  18-21
    1.6.1 酶法测定  19
    1.6.2 电位滴定法  19
    1.6.3 改良坂口法  19-20
    1.6.4 高效液相色谱法  20-21
    1.6.5 百里酚分光光度法  21
  1.7 本论文的研究内容  21-22
第二章 L-Arg培养基的优化  22-32
  2.1 引言  22
  2.2 材料与方法  22-24
    2.2.1 实验材料  22
    2.2.2 实验方法  22-24
  2.3 结果与讨论  24-31
    2.3.1 菌体生长曲线的测定  24
    2.3.2 L-Arg标准曲线的绘制  24-25
    2.3.3 葡萄糖浓度对发酵的影响  25-26
    2.3.4 硫酸铵浓度对发酵的影响  26-27
    2.3.5 碳酸钙浓度对发酵的影响  27
    2.3.6 硫酸镁浓度对发酵的影响  27-28
    2.3.7 磷酸二氢钾浓度对发酵的影响  28-29
    2.3.8 生物素的最佳添加量  29
    2.3.9 硫胺素的最佳添加量  29-30
    2.3.10 培养基优化前后的产量对比  30-31
  2.4 本章小结  31-32
第三章 L-Arg产生菌的诱变育种  32-44
  3.1 引言  32
  3.2 材料与方法  32-35
    3.2.1 实验材料  32-33
    3.2.2 实验方法  33-35
  3.3 结果与讨论  35-43
    3.3.1 出发菌株的遗传标记考察  35-36
    3.3.2 紫外单因子诱变  36-38
    3.3.3 硫酸二乙酯单因子诱变  38-40
    3.3.4 UV+DES复合诱变  40-43
  3.4 本章小结  43-44
    3.4.1 L-Arg产生菌BC307130315的选育谱系  43
    3.4.2 结论  43-44
第四章脯氨酸营养缺陷型菌株的选育  44-54
  4.1 引言  44
  4.2 材料与方法  44-47
    4.2.1 实验材料  44-45
    4.2.2 实验方法  45-47
  4.3 结果与讨论  47-52
    4.3.1 谷氨酸棒杆菌的代谢网络  47
    4.3.2 菌株BC30713031584的选育谱系图  47-48
    4.3.3 无氮培养基培养时间的确定  48
    4.3.4 二氮培养基培养时间的确定  48-49
    4.3.5 青霉素添加量和处理时间的确定  49-50
    4.3.6 营养缺陷型突变株的检出  50
    4.3.7 传代稳定性复筛  50-51
    4.3.8 结构类似物抗性检测  51-52
  4.4 本章小结  52-54
第五章发酵调控的初步研究  54-62
  5.1 引言  54
  5.2 材料与方法  54-55
    5.2.1 实验材料  54-55
    5.2.2 实验方法  55
  5.3 结果与讨论  55-61
    5.3.1 菌株BC30713031584的发酵过程曲线  55-56
    5.3.2 分批补加碳源的效果  56-57
    5.3.3 分批补加氮源的效果  57-58
    5.3.4 L-Arg代谢网络分析  58-59
    5.3.5 添加天冬氨酸对发酵的影响  59
    5.3.6 添加谷氨酸对发酵的影响  59-60
    5.3.7 添加草酸和丙二酸对发酵的影响  60-61
  5.4 本章小结  61-62
第六章结论与展望  62-64
  6.1 研究工作所得结论  62-63
  6.2 本课题的展望  63-64
参考文献  64-68
实验所用仪器和试剂清单  68-70
  实验仪器  68
  实验试剂  68-70
研究成果及发表的学术论文  70-71
致谢  71-72
作者和导师简介  72-73
硕士研究生学位论文答辩委员会决议书  73-74

L-精氨酸高产菌种的选育及发酵研究

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