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小菜蛾高毒力苏云金芽胞杆菌的筛选与分子特性研究

作　者: 王一喆
导　师: 李建洪；冯夏
学　校: 华中农业大学
专　业: 农药学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 生物活性 分离株XF50 小菜蛾 LC50 生理生化鉴定 分子特性鉴定
分类号: S476.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本文以华中农业大学农药实验室自行分离保藏的29株对鳞翅目(Lepidoptera)害虫有活性的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)分离株为菌种资源,筛选对小菜蛾Plutella xylostella (L)毒力最高的Bt菌株。文章通过室内生物活性测定、培养特征鉴定、生长特征鉴定、生理生化鉴定、质粒图谱分析、SDS-PAGE分析、PCR反应鉴定及PCR-RFLP鉴定,对分离株进行了全面研究,目的在于为小菜蛾防治提供新的Bt菌种资源,并为其进一步开发利用打好理论基础。1.生物活性测定以小菜蛾3龄幼虫为试虫,对29株苏云金芽胞杆菌分离株进行初筛。在所测定的Bt分离株中,有5株对小菜蛾3龄幼虫表现出较高杀虫活性。其发酵液1000倍稀释液3d后对小菜蛾的校正死亡率均达到65%以上。对5株分离株进行复筛,筛选出了对小菜蛾有最高生物活性的分离株XF50。以标准株库斯塔克亚种HD73和工程菌WG-001为对照,比较了三者对小菜蛾和甜菜夜蛾的生物活性。实验结果表明,XF50对小菜蛾和甜菜夜蛾的生物活性均高于标准株HD73和工程菌WG-001。分离株XF50对小菜蛾和甜菜夜蛾的LC50分别为2.08×106cfu/ml和11.80×107cfu/ml。2.生长特性及生理生化鉴定分离株XF50与标准株HD73的培养及生长特征极其相似,均形成典型的菱形伴孢晶体蛋白,蛋白晶体和营养体细胞大小相当。生长延迟期都非常短,只有2h左右,2-16 h进入指数生长期,16h后进入稳定期,32h后进入衰亡期。不同培养基上菌落均呈圆形,表面或光滑或粗糙,但都无可溶性色素生成；生理生化指标鉴定与标准株HD73完全一致,均不能水解明胶；吲哚实验呈阴性；可水解淀粉、卵磷脂和脲；V.P.反应呈阳性；均不能分解D-葡萄糖、蔗糖和D-甘露醇。推断该分离株很有可能是库斯塔克亚种。3.分子特性鉴定分离株XF50与工程菌WG-001质粒图谱有明显差异,除了都能表达大小约为70Kb、23 Kb的大质粒条带外,XF50还能表达大小约为50 Kb、6.7 Kb、4.2 Kb、3.8 Kb、2.3 Kb、2.0 Kb左右的质粒条带；SDS-PAGE图谱显示XF50至少能表达大小约为135 KDa和65 KDa两条主蛋白条带；基因型鉴定结果显示筛选株XF50除含有cry2基因型外,还含有丰富的cry1类基因,即cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, crylI,而标准株只含cry1Ac基因；PCR-RFLP酶切图谱分析验证了PCR鉴定结果的正确性。通过双酶切鉴定出了基因cry1Aa、cry1Ac、cry1I和cry2Ab。实验结果表明：Bt分离株XF50杀虫活性高,基因类型丰富,克服了单一基因易产生抗性的缺陷。本文不仅为小菜蛾防治提供了新的菌种资源,更为工程菌的研制提供了理论基础,具有进一步开发和利用的价值。

全文目录


目录  4-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表  11-12
第一章 文献综述  12-26
  1 苏云金芽胞杆菌研究进展  12-21
    1.1 苏云金芽胞杆菌研究概况  12-13
    1.2 杀虫晶体蛋白及杀虫晶体蛋白基因  13-14
    1.3 苏云金芽胞杆菌的杀虫机理  14-15
    1.4 苏云金芽胞杆菌作为生物杀虫剂及其他用途的应用研究  15-21
      1.4.1 应用研究概况  15-18
      1.4.2 抗性问题  18-21
  2 小菜蛾防治研究进展  21-25
    2.1 物理防治  21-22
    2.2 化学防治  22
    2.3 农业防治  22-24
      2.3.1 蔬菜品种  22
      2.3.2 品种时空布局  22-24
    2.4 生物防治  24
    2.5 Bt防治小菜蛾现状  24-25
  3 本研究的目的与意义  25-26
第二章 分离株对小菜蛾生物活性研究  26-37
  1 材料与方法  26-28
    1.1 分离株和培养基  26
      1.1.1 供试分离株  26
      1.1.2 培养基  26
    1.2 试虫  26-27
    1.3 菌株的培养  27
    1.4 分离株发酵液的制备  27
    1.5 菌株的复壮与纯化  27
    1.6 生物活性测定  27-28
  2 结果与分析  28-35
    2.1 29株分离株对小菜蛾生物活性初筛结果  28-30
    2.2 5株分离株对小菜蛾生物活性复筛结果  30-32
    2.3 分离株XF50 Ld-p线测定  32
    2.4 分离株XF50与标准株HD73及工程菌WG-001生物活性比较  32-35
      2.4.1 对小菜蛾毒力测定  32-34
      2.4.2 对甜菜夜蛾毒力测定  34-35
  3 讨论  35-37
第三章 新菌株分子特性研究  37-58
  1 材料与方法  37-47
    1.1 试验材料  37-41
      1.1.1 供试菌株  37
      1.1.2 常用培养基  37-38
      1.1.3 常用试剂及溶液  38-40
      1.1.4 常用仪器设备  40
      1.1.5 常用试剂盒  40-41
    1.2 试验方法  41-47
      1.2.1 形态观察  41
      1.2.2 培养特征  41
      1.2.3 生理生化反应  41
      1.2.4 生长情况观察  41
      1.2.5 伴孢晶体蛋白SDS-PAGE分析  41
      1.2.6 Bt菌株质粒DNA的提取  41-42
      1.2.7 琼脂糖凝胶电泳  42-43
      1.2.8 PCR反应  43-45
      1.2.9 cry基因PCR产物的克隆和PCR-RFLP分析  45-47
  2 结果与分析  47-56
    2.1 分离株培养形状及形态观察  47
    2.2 培养特征和生理生化反应  47-49
    2.3 分离株XF50和HD73的生长特性  49
    2.4 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE分析  49-50
    2.5 质粒DNA图谱分析  50-51
    2.6 杀虫晶体蛋白基因型鉴定  51-53
    2.7 PCR-RFLP分析  53-56
  3 讨论  56-58
第四章 全文总结  58-61
  1 论文研究的主要结论  58-59
    1.1 生物活性测定  58
    1.2 生长特性及生理生化鉴定  58-59
    1.3 分子特性鉴定  59
  2 文章的创新之处  59
  3 展望  59-61
参考文献  61-72
致谢  72

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用 > 昆虫真菌
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