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小球藻异养/光诱导切换过程的分子响应及其功能基因组学研究

作　者: 范建华
导　师: 李元广; 徐健
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 微藻能源蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导基因组转录组
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

随着化石燃料的日益枯竭及实现低碳经济的迫切需要,微藻能源已成为世界各国重点研究与发展的战略方向,但是文献中对微藻油脂合成和积累及环境互作机制这一关键问题的研究少有报道,限制了微藻能源的产业化。基于首创的异养-稀释-光诱导串联技术和高产油蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)良种,可实现集“高附加值微藻产品、微藻能源与生物固碳”的一体化开发,有望加快微藻能源和微藻固碳的产业化进程,但目前对该技术缺乏机理方面的认识,致使其工艺的优化放大缺乏理论指导。此外,目前国内外均未见可户外大规模培养的淡水能源微藻的基因组报道,严重制约了淡水能源微藻生理性状的进一步挖掘和大规模应用。C. pyrenoidosa不仅可生产高附加值小球藻粉,而且高产油脂,是一株具有广阔应用前景的淡水工业藻种,但迄今未见有关该藻遗传背景研究方面的报道,因而亟待深入研究。本文针对微藻能源产业化开发中基础科学问题——能源微藻胞内代谢及油脂合成与积累的系统生物学机制这一热点方向开展研究。首先,围绕异养-稀释-光诱导串联培养过程,首次发现小球藻异养细胞经光诱导处理后可在短时间内(12h)提高油脂含量近1倍；据此开展了C. pyrenoidosa的全基因组测序,揭示了首个淡水能源微藻的全基因组图谱；然后,运用RNA-seq,首次分析了小球藻在异养和光诱导下的基因转录图谱,鉴定发现2800多个差异表达基因,并在全局转录水平阐述了小球藻胞内碳流在油脂、蛋白、色素、淀粉之间的协调分配和调控规律；最后,基于基因组和转录组信息,首次重构了C. pyrenoidosa的中心碳代谢、油脂和淀粉代谢途径。具体表述如下：(1)异养／光诱导切换过程的生化和细胞水平变化规律。首次发现异养转入光诱导后,小球藻油脂含量可在12h内提高约1倍,预示着小球藻特殊的油脂代谢调控能力；此外,C. pyrenoidosa胞内蛋白质、叶绿素和叶黄素等活性物质含量均在短时间内(8-12h)提高了1倍左右,同时碳水化合物的含量显著下降；细胞超微结构研究发现异养转入光诱导后,淀粉粒逐渐消失和蛋白核迅速形成,进一步表明蛋白、油脂和色素等组分快速积累和碳水化合物的降解密切相关；上述变化特征在另外两株小球藻C. vulgaris和C. ellipsoidea中,以及在实验室内和户外小型光反应器中的分析结果一致,表明异养-稀释-光诱导串联培养技术具有一定的普适性；异养-稀释-光诱导技术培养C. pyrenoidosa的油脂产率最大可达89.89mg/L/d,且脂肪酸碳链组成主要为C16-C18,满足制备生物柴油的要求。(2)全基因组图谱绘制。首次对一株淡水高产油C. pyrenoidosa进行了全基因组测序,经序列拼接和组装,高质量绘制了C. pyrenoidosa的基因组草图。该藻基因组大小约为56.6Mb,含1,336个scaffold,均大于2Kb,N50为1.39Mb,测序深度达26×；基因组的GC含量较高,达66.6%,含3.1%的重复序列；核基因组编码10,284个基因,平均每个基因含近9个内含子,平均的基因转录本长度为1,674bp,编码的蛋白质平均含有462个氨基酸；80.9%的基因有cDNA序列的支持,87.4%的基因可以在NCBI非冗余蛋白质数据库中找到同源序列(e-value<1e-5)；密码子的第三位碱基对鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)存在显著的偏好性,确定了29个偏好密码子；有1,109个叶绿体转运肽和2,437个线粒体靶向肽,分别占核基因组编码蛋白的10.8%和23.7%。(3)蛋白功能和进化分析。C. pyrenoidosa基因组具有编码减数分裂关键蛋白的全部基因,转录组数据显示部分基因有明显的表达,表明C. pyrenoidosa可能具有较为隐秘的有性生殖过程；参与细胞壁代谢的基因和Chlorella NC64A显著不同,具有编码纤维素和半纤维素合成酶的基因家族,具有植物和藻类界中罕见的几丁质代谢途径。C.pyrenoidosa在进化地位上和绿藻门以及绿色植物亲缘关系很近；绿藻家族光合作用相关基因进化非常保守,而油脂和碳水化合物代谢的基因最容易受到自然选择的作用,属水平上的Ka/Ks值明显大于门水平,表明微藻在较低进化地位上的功能基因,进化速率相对较高。(4)异养／光诱导切换过程的转录水平表达机制。首先构建了异养及转入光诱导后正反抑制性差减文库,经大规模ESTs测序和功能分析,鉴定出大量参与能量代谢、氨基酸代谢、蛋白质合成、碳水化合物代谢和压力胁迫应激等生物学过程的基因发生差异表达,初步确定了转录水平的调控是重要因素。进一步对异养和光诱导过程共6个时间点的样品进行了RNA-seq,共产生187,503,403条高质量reads,总的测序深度达到300×,共有9,927(97%)个基因有转录组的数据支持(FPKM值>1)；分别挖掘到1,578个和1,491个基因在异养两个时间点(24h和72h)以及转入光照后3个时间点(2h、8h和24h)发生了3倍以上的差异表达。KEGG代谢途径分析表明,在异养生长过程中,TCA循环和氨基酸代谢等途径发生了显著的上调；而脂肪酸合成、光合作用、卡尔文循环、磷酸戊糖途径以及核酸代谢相关的途径发生了下调。相反,当异养细胞转入光诱导后,参与C3固定、光合作用、脂肪酸合成、磷酸戊糖途径和淀粉代谢相关的基因发生了显著的上调。这一转录组结果,首次在全局水平揭示了不同营养模式下,微藻胞内碳流在油脂、蛋白和碳水化合物组分之间发生的协调分配,是受不同时间点上的葡萄糖供给和光照因素的共同影响,并在转录组水平上发生的多基因多代谢途径共同调控的结果。最后,根据基因组和转录组分析结果,首次重构了C. pyrenoidosa的中心碳代谢和油脂合成代谢途径,部分代谢节点上发生差异表达的关键基因(如Ⅱ型二酰基甘油酰基转移酶)可作为基因工程改造的靶标。本文的研究与目前正在进行的异养-稀释-光诱导串联培养技术的产业化开发互为依托,可为系统阐明能源微藻细胞生长和油脂积累与环境响应的机制,进一步通过基因工程和系统生物学调控手段提高能源微藻的生长和油脂合成速率奠定理论和实验依据,具有重要的工业应用价值和较高的学术价值。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
目录  11-15
第1章前言  15-33
  1.1 微藻能源研究概况  15-16
  1.2 小球藻的生物学特性及其应用概述  16-17
    1.2.1 小球藻的分类和生物学特性  16
    1.2.2 小球藻的应用和市场前景  16-17
  1.3 微藻高效培养模式  17-21
    1.3.1 微藻常见培养模式  17-18
    1.3.2 小球藻培养模式及存在问题  18-19
    1.3.3 异养-稀释-光诱导串联培养技术  19-21
  1.4 微藻胞内生化组分合成和代谢的调控方式  21-23
  1.5 藻类基因组学和转录组学研究进展  23-30
    1.5.1 原核藻类基因组学研究  23
    1.5.2 真核藻类基因组学研究  23-29
    1.5.3 微藻转录组学研究  29-30
  1.6 本文的研究目的、意义和主要研究内容  30-33
第2章小球藻异养/光诱导切换过程的生化和细胞水平变化特征与分析  33-47
  2.1 引言  33
  2.2 材料与方法  33-35
    2.2.1 藻种和培养基  33
    2.2.2 培养方法  33-34
    2.2.3 藻细胞密度测定  34
    2.2.4 碳水化合物的测定  34
    2.2.5 蛋白质含量测定  34
    2.2.6 叶绿体色素含量测定  34
    2.2.7 油脂含量的测定  34-35
    2.2.8 脂肪酸组成分析  35
    2.2.9 细胞显微和亚显微结构的观察  35
  2.3 结果与讨论  35-45
    2.3.1 异养-稀释-光诱导培养过程中的藻细胞生长特性  35-37
    2.3.2 异养-稀释-光诱导串联培养过程中藻细胞内生化成分变化规律  37-41
    2.3.3 细胞显微和亚显微结构变化特征  41-43
    2.3.4 油脂含量的快速积累和脂肪酸组成变化  43-45
  2.4 本章小结  45-47
第3章小球藻异养/光诱导消减杂交文库的构建和ESTS功能分析  47-74
  3.1 引言  47-48
  3.2 材料和方法  48-55
    3.2.1 蛋白核小球藻的培养和总RNA提取  48
    3.2.2 mRNA分离和cDNA合成  48-49
    3.2.3 RsaⅠ酶切和接头连接  49-50
    3.2.4 杂交及PCR扩增  50-52
    3.2.5 PCR产物纯化  52-53
    3.2.6 T-载体连接、转化和单克隆检测  53-54
    3.2.7 正反消减文库ESTs测序、数据处理与功能分析  54
    3.2.8 差异表达基因的半定量RT-PCR验证  54-55
  3.3 结果和讨论  55-73
    3.3.1 小球藻总RNA的提取与mRNA的分离  55-56
    3.3.2 cDNA合成与酶切效果分析  56-57
    3.3.3 接头连接及文库插入片段的检测  57-58
    3.3.4 正反消减文库的特性分析  58-60
    3.3.5 序列装配、功能注释及生物信息学分析  60-63
    3.3.6 差异表达基因的RT-PCR表达分析  63-64
    3.3.7 差异表达ESTs生物学功能分析  64-73
  3.4 本章小结  73-74
第4章蛋白核小球藻全基因组测序和分析  74-100
  4.1 引言  74
  4.2 材料和方法  74-79
    4.2.1 蛋白核小球藻藻种及培养条件  74-75
    4.2.2 蛋白核小球藻基因组DNA的提取和18S rDNA鉴定  75
    4.2.3 基于Roche 454 GS-FLX Titanium的全基因组测序  75-76
    4.2.4 454数据的质量控制  76-77
    4.2.5 重叠区的拼接及基因组骨架的组装  77
    4.2.6 蛋白核小球藻基因结构的预测  77-78
    4.2.7 蛋白核小球藻细胞核编码基因的功能注释  78
    4.2.8 小球藻氨基酸和密码子使用偏好性分析  78
    4.2.9 前导肽和蛋白的亚细胞定位预测  78-79
    4.2.10 基因组的重复序列标识  79
    4.2.11 有性生殖和减数分裂相关基因的预测  79
  4.3 结果和讨论  79-98
    4.3.1 蛋白核小球藻基因组DNA的质量控制  79-80
    4.3.2 蛋白核小球藻的18S rDNA鉴定和进化地位  80-82
    4.3.3 基因组测序数据的QC处理及拼接组装  82-84
    4.3.4 基因结构的预测和功能注释  84-89
    4.3.5 小球藻的氨基酸及密码子使用频率分析  89-94
    4.3.6 蛋白核小球藻核基因组编码蛋白的前导肽和亚细胞定位分析  94-95
    4.3.7 蛋白核小球藻基因组的重复序列分析  95-97
    4.3.8 蛋白核小球藻参与减数分裂和有性生殖过程的基因分析  97
    4.3.9 蛋白核小球藻参与细胞壁代谢基因分析  97-98
  4.4 本章小结  98-100
第5章单细胞真核微藻的比较基因组学研究  100-115
  5.1 引言  100
  5.2 材料和方法  100-102
    5.2.1 核基因组编码蛋白的同源性比较分析  100-101
    5.2.2 核心和特异性蛋白质组的鉴定和分析  101
    5.2.3 直系同源基因的鉴定  101
    5.2.4 直系同源基因的进化选择压力计算和功能注释  101-102
  5.3 结果和讨论  102-114
    5.3.1 蛋白核小球藻核基因组蛋白序列的遗传特性  102-104
    5.3.2 蛋白核小球藻基因组编码蛋白的功能多样性分析  104-106
    5.3.3 绿藻直系同源基因的鉴定和分析  106-107
    5.3.4 绿藻直系同源基因的功能和进化分析  107-114
  5.4 本章小结  114-115
第6章蛋白核小球藻异养/光诱导切换过程的转录组学研究  115-135
  6.1 引言  115
  6.2 材料和方法  115-117
    6.2.1 藻种和培养条件  115-116
    6.2.2 转录组文库构建方法和测序  116
    6.2.3 测序reads统计分析  116
    6.2.4 基因表达水平标准化处理  116
    6.2.5 差异表达基因和代谢途径分析  116-117
  6.3 结果和讨论  117-133
    6.3.1 RNA-seq reads统计分析  117-120
    6.3.2 差异表达基因的聚类和功能分析  120-124
    6.3.3 异养和中心碳代谢途径重构和表达调控  124-127
    6.3.4 光合作用和色素代谢相关途径表达调控  127-128
    6.3.5 脂肪酸和甘油酯合成代谢途径的重构和差异表达  128-132
    6.3.6 淀粉合成和代谢途径及其差异表达  132-133
  6.4 本章小结  133-135
第7章结论和展望  135-139
  7.1 研究结论  135-137
  7.2 特色与创新之处  137
  7.3 展望与建议  137-139
参考文献  139-153
攻读学位期间的主要研究成果  153-155
致谢  155-157
个人简介  157-158
附录  158-169

小球藻异养/光诱导切换过程的分子响应及其功能基因组学研究

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