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奶牛S100A12基因克隆、原核表达及表达产物抗菌活性分析

作　者: 雍康
导　师: 刘长松；曹随忠
学　校: 四川农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 奶牛 S100A12基因分子克隆原核表达抗菌活性
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乳房炎可诱导奶牛乳腺组织、外周血液和牛奶中S 100A12成倍表达,提示在乳房炎的发生和防御过程中S100A12发挥重要的作用。在前期研究中成功构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库及反向Northern斑点杂交差异筛选获得S100A12基因片段的基础上,本研究对奶牛外周血液中S100A12基因进行了分子克隆与序列分析,构建了原核表达载体pCold TF-S100A12,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并检测了重组蛋白对牛源乳房炎主要致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌效果。1.利用RT-PCR从奶牛外周血液中克隆S100A12基因,将其连接到pMDTM 19-T Simple载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,结果表明重组克隆质粒pMD19-T-S100A12构建成功。生物信息学分析得知,扩增片段大小为291bp,含有一个279bp的完整开放阅读框(ORF),编码92个氨基酸的成熟多肽,并且含有S100A12蛋白的特征性分子结构即在特定位置上有1个EF-手型结构;另外,还预测到三个蛋白激酶C磷酸化位点,分别位于19-21,44-46和70-73氨基酸残基。与已报道的牛S100A12 cDNA序列(登录号：NM 174651)进行比较,核苷酸序列相似性为100%,序列覆盖编码区全长。进化树分析结果显示,奶牛S100A12基因与人、猪、猿猴S100A12基因亲缘关系比较近。2.应用RT-PCR检测发现S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系统(卵巢、输卵管、子宫颈、子宫体、阴道)上皮组织中均有表达。3.BamHI和Hind III双酶切克隆质粒pMD19-T-S100A12,酶切产物与原核表达载体pCold TF连接,经质粒PCR、双酶切和测序鉴定结果表明重组原核表达质粒PCold TF-S100A12构建成功。将重组质粒pCold TF-S100A12转入高效表达菌株BL21(DE3),诱导培养后,重组菌株特异性表达大小为62kDa的蛋白条带,通过诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间的优化确定了最佳诱导条件(37℃,1.0 mmol/L IPTG,诱导表达4h). SDS-PAGE和Western blotting分析显示克隆的S100A12基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的46.7%。4.Ni-TED亲和层析法将表达的蛋白进行纯化,用Bradford法检测得知表达的蛋白浓度为0.5mg·mL-1。用纸片扩散法测定纯化的重组蛋白对大肠杆菌有抗菌效果,而对金黄色葡萄球菌没有抗菌作用。本试验结果为进一步研究奶牛S100A12基因的表达特性、基因功能和抗体的制备及筛选乳房炎早期诊断指标奠定了基础,同时为重组多肽治疗和预防奶牛乳房炎以及抗乳房炎奶牛的育种提供了相应资料。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-17
  1 S100蛋白的分类及分布  11-12
  2 S100A12基因,mRNA和蛋白质结构及离子结合特性  12-14
  3 S100A12与晚期糖基化终末产物受体的关系  14-15
  4 S100A12组织及亚细胞定位  15
  5 S100A12在不同疾病与组织中的表达  15-16
  6 展望  16-17
第二章奶牛S100A12基因克隆及其在乳腺和生殖系统中的表达  17-30
  1 实验材料  17-19
    1.1 实验动物及样品采集  17-18
    1.2 菌株与克隆载体  18
    1.3 主要试剂  18
    1.4 主要溶液的配制  18-19
      1.4.1 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  18-19
      1.4.2 培养细菌所用溶液  19
    1.5 主要仪器与设备  19
  2 试验方法  19-23
    2.1 引物设计与合成  19
    2.2 中国荷斯坦奶牛外周血总RNA的抽提  19-20
    2.3 RT-PCR扩增S100A12基因  20
    2.4 扩增产物的回收和纯化  20-21
    2.5 S100A12基因的连接转化与鉴定  21-23
      2.5.1 连接及转化  21
      2.5.2 阳性转化子的鉴定  21-22
      2.5.3 S100A12基因序列测定及序列分析  22-23
    2.6 S100A12在奶牛乳腺和生殖系统中的表达分析  23
  3 结果与分析  23-27
    3.1 奶牛S100A12基因的RT-PCR扩增  23
    3.2 重组质粒的酶切和PCR鉴定  23-24
    3.3 DNA序列分析  24-26
    3.4 S100A12在奶牛乳腺和生殖器官中的表达  26-27
  4 讨论  27-30
第三章奶牛S100A12基因原核表达、蛋白纯化及抗菌活性研究  30-47
  1 实验材料  30-33
    1.1 菌株和载体  30-31
    1.2 主要试剂  31
    1.3 主要溶液的配制  31-32
      1.3.1 SDS-PAGE电泳相关溶液  32
      1.3.2 Western-blotting相关溶液  32
    1.4 主要仪器设备  32-33
  2 试验方法  33-37
    2.1 重组质粒pCold TF-S100A12的构建流程  33
    2.2 重组克隆质粒pMD19-T-S100A12及表达质粒pCold TF的提取、酶切与回收  33-34
    2.3 连接与转化  34
    2.4 重组阳性转化子的鉴定  34
    2.5 重组蛋白的诱导表达及条件优化  34-36
      2.5.1 重组蛋白在宿主菌中的分布  34-35
      2.5.2 诱导温度优化  35
      2.5.3 IPTG浓度的优化  35
      2.5.4 诱导时间的优化  35-36
      2.5.5 重组蛋白的纯化  36
      2.5.6 Western-blotting检测  36
    2.6 纯化的目的蛋白含量测定  36
    2.7 S100A12的活性检测  36-37
  3 结果与分析  37-44
    3.1 重组表达质粒pCold TF-S100A12的鉴定  37-38
    3.2 重组蛋白的诱导表达及条件优化  38-41
      3.2.1 重组蛋白在宿主菌中的分布  38-39
      3.2.2 诱导温度优化  39
      3.2.3 IPTG浓度的优化  39-40
      3.2.4 诱导时间的优化  40-41
      3.2.5 重组蛋白的纯化  41
    3.3 Western blotting检测  41-42
    3.4 重组蛋白的浓度测定  42-43
    3.5 S100A12重组蛋白普通LB平板上的活性测定  43-44
  4 讨论  44-47
    4.1 外源基因的融合表达  44
    4.2 诱导表达及诱导条件的优化  44-45
    4.3 S100A12重组蛋白的抗菌活性  45-47
结论  47-48
参考文献  48-55
致谢  55

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