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液质联用及药物筛选技术在中药毒性研究中的应用探索

作　者: 陆倍倍
导　师: 高月; 王宇光
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 液质联用药物相互作用筛选中药毒性十八反孕烷X受体
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 271次
引　用: 2次
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内容摘要

中药使用日益广泛,与此同时,中药安全性和不良反应的问题也日益显现,这使得中药毒性的研究也显得越来越重要,中药毒性研究的现代化及标准化研究平台的建立迫在眉睫。本研究以“十八反”为研究对象,综合采用液质联用和药物筛选技术,分别从中药配伍毒性成分变化的化学实质和药物代谢酶对中药毒性成分代谢影响的生物学实质两个层面进行中药毒性的探索性研究,为准确、科学地揭示中药毒性的科学内涵搭建相关技术平台并积累数据,从而为科学阐明中药配伍产生相反作用的机制和中药“十八反”配伍禁忌提供实验依据。中药临床疗效或毒性的物质基础是其化学成分的总和。中药化学组成非常复杂,常规手段难以对相反药对配伍的化学成分谱及毒性成分谱进行全景式分析,而UPLC与Q-TOF-MS联用(UPLC/Q-TOF-MS)技术让中药配伍化学成分变化研究成为可能。藜芦分别与北沙参、党参配伍合煎的实验结果显示,藜芦与北沙参配伍合煎后显著增加的生物碱主要为伪芥芬胺、藜芦嗪和藜芦新碱等;而当归酰棋盘花胺、藜芦胺碱、计米定碱含量降低。藜芦与党参配伍合煎后仅有伪芥芬胺含量显著增加;其他的藜芦类生物碱如计米定碱、藜芦嗪、藜芦胺碱、芥芬胺等含量却降低。说明藜芦与北沙参可能存在配伍后的增毒减效机制,而与党参配伍则不明显,初步从体外化学成分的角度阐释了其配伍增毒的物质基础。中医用药特点为合并用药,复方为主,故易产生药物间的相互作用;同时中药成分面临细胞色素P450酶(cytochromeP450,CYP450)及对其的诱导或抑制,因此中药发生相互作用的机制也必然与药物代谢相关,尤其是与CYP450有关的代谢。因此发展基于CYP450的药物相互作用筛选技术对理解中药配伍毒性的生物学本质是一种有益的思路和方法。本研究通过构建新颖的双远端增强子和近端启动子线性串联的分泌型荧光素酶报告基因并稳定转染HepG2细胞,实现直接检测上清即能预测化合物的CYP3A4诱导或抑制能力,克服现有pGL系列双荧光素酶报告基因需要裂解细胞、步骤繁琐的不足。在瞬转对比实验中,单远端增强子的分泌型荧光素酶报告基因表现出比单远端增强子的pGL4.17报告基因更优越的RIF诱导响应性能;双远端增强子的分泌型荧光素酶报告基因不仅绝对荧光值要显著高于单远端增强子分泌型荧光素酶报告基因,而且RIF诱导效能也有进一步提高。CYP3A4阳性诱导药物和孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)抑制药物的稳定转染细胞株验证实验,进一步表明构建的新的报告基因法准确、可靠。利用此体外筛选细胞模型,对70种中药化学成分单体进行了筛选实验,获得了具有潜在CYP3A4诱导和抑制能力的目标化合物,为进一步分析中药配伍后毒性成分代谢的变化与中药配伍毒性关系研究提供了重要线索。以上技术平台的建立,为基于体内药物相互作用的中药毒性研究提供了新的思路和方法。

全文目录

英文缩略词  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-14
一、基于液质联用技术的藜芦配伍禁忌的化学研究  14-28
  材料和方法  14-18
    1 材料  14-15
    2 方法  15-18
  结果  18-25
    1 藜芦与北沙参配伍的化学成分定性分析研究  18-22
    2 藜芦与党参配伍的化学成分定性分析研究  22-25
  讨论  25-28
二、基于PXR-CYP3A4 通路的药物相互作用筛选体系建立  28-67
  材料和方法  29-40
    1 材料  29-30
    2 方法  30-40
  结果  40-64
    1 载体构建  40-45
    2 G418 工作浓度筛选  45
    3 pGL4.17-3A4 和1 号质粒的瞬时转染比较实验  45-46
    4 1 号和9 号质粒的瞬时转染比较实验  46-49
    5 9 号质粒的稳定共转染实验  49-50
    6 稳定转染细胞株利福平诱导鉴定  50-52
    7 阳性化学药物对9+PXR-3 荧光诱导活性  52-53
    8 PXR 抑制剂酮康唑对9+PXR-3 荧光诱导活性的影响  53-55
    9 利福平浓度梯度对9+PXR-3 荧光诱导活性的影响  55-58
    10 细胞密度对9+PXR-3 荧光诱导活性的影响  58-61
    11 不同血清条件和加药时间对9+PXR-3 荧光诱导活性的影响  61-64
  讨论  64-67
三、基于 PXR-CYP3A4 通路的药物相互作用筛选体系在中药毒性研究中应用  67-89
  材料和方法  68-69
    1 材料  68
    2 方法  68-69
  结果  69-87
    1 “十八反”中药化学成分CYP3A4 诱导活性筛选  69-76
    2 中药化学成分CYP3A4 诱导活性筛选  76-84
    3 部分潜在PXR 抑制活性中药化学成分筛选验证  84-87
  讨论  87-89
总结  89-91
参考文献  91-96
综述  96-107
  参考文献  101-107
个人简历  107-109
致谢  109

液质联用及药物筛选技术在中药毒性研究中的应用探索

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