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本课题首先采用实验室已有质粒表达获得了人CYP2C9(*1,*3,*13,*16),CYP2C8(*1,*2,*3,*4),CYP2C19(*1,*2)和CYP2D6*1重组酶；建立了基于稳定同位素标记质谱识别技术的氟西汀(Fluoxetine, Flx)及其代谢物诺氟西汀(Norfluoxetine, Nflx)的手性LC-MS/MS分析方法；考察了11个重组酶亚型催化氟西汀代谢的立体选择性。1人重组酶在Sf9细胞中的表达和活性鉴定目的通过杆状病毒-昆虫表达系统表达人CYP2C9(*1,*3,*13,*16),CYP2C8(*1,*2,*3,*4),CYP2C19(*1,*2)和CYP2D6*1重组酶,并在蛋白表达水平和活性水平进行鉴定。方法从实验室已保存的DH10Bac-pFastbac-CYP2C9 (*1,*3,*13,*16), DH10Bac-pFastbac-CTP22D6*1, DH10Bac-pFastbac-CYPOR, DH10Bac-pFastbac-CYPB5等菌中分别提取重组粘粒(Bacmid-CYP2C9*1,*3,*13, *16, Bacmid-CYP2D6*1, Bacmid-CYPOR, Bacmid-CYPB5),转染Sf9细胞,产生重组杆状病毒,扩增得到的较高滴度的病毒。通过荧光定量PCR测定其滴度后,利用靶病毒和OR,B5病毒共同感染Sf9细胞获得野生型和突变体重组酶(CYP2C8和CYP2C19直接利用实验室已有靶病毒表达重组酶)。采用Western blot检测重组酶在蛋白质水平的表达。利用重组酶与各自经典底物共孵育孵育,LC-MS法检测代谢产物确定重组酶的活性。结果Western blot检测到55 kD左右有清晰条带出现,与重组酶预期大小一致,表明目的蛋白在细胞中得到良好表达。与经典底物共孵育实验表明重组酶活性良好。结论所述各种重组酶均在Sf9细胞得到成功表达,代谢活性良好,可用于后续体外代谢实验。2立体选择性定量分析Fix和Nflx对映体方法的建立目的建立一个灵敏,快速,可高通量选择性定量测定Fix及其去甲基化代谢产物Nflx的方法,用于生物样本(体外孵育液)中Fix及代谢产物Nflx的检测,进而考察重组酶催化氟西汀的体外代谢情况。方法利用质谱高灵敏度和选择性的特点,结合稳定同位素标记技术,开发可同时选择性定量分析Fix对映体及其代谢产物Nflx对映体的LC-MS/MS方法。结果方法学验证实验结果表明,此法对R-Flx在1～1000 ng·mL-1, S-Flx-d5在1～1000 ng·mL-1, R-Nflx在0.1～100 ng·mL-1, S-Nflx-d5在0.1～100 ng·mL-1内线性关系皆良好(R^2>0.999),R-Flx定量限1 ng·mL-1 (S/N>10, RSD= 5.5%), S-Flx-d5定量限1 ng·mL-1 (S/N>10, RSD=6.1%), R-Nflx定量限0.1 ng·mL-1 (S/N>10, RSD = 6.5%), S-Nflx-d5定量限0.1ng·mL-1(S/N>10,RSD=7.6%),方法回收率在96.9%-109.2%,日内、日间精密度RSD均<10%。结论建立的LC-MS分析方法灵敏、准确、专属性强,可用于Fix及其代谢产物Nflx对映体在孵育生物样本中的定量检测。3 Flx体外孵育代谢研究目的测定所得各种人重组酶催化R,S和+F1x的酶动力学参数,考察CYP2C9催化下单映体R和S-Flx之间的相互作用。方法在优化过的孵育时间和酶浓度条件下,将一系列浓度的R,S和+Fix分别与重组酶共孵育,以代谢产物Nflx生成速率对底物浓度作图,计算酶动力学参数。选定R-Flx或S-Flx的浓度,选用一系列不同浓度其对映体,与CYP2C9重组酶共孵育,测定由R或S-Flx生成代谢产物的速率,以不加其对映体代谢产物生成量为100%,加入其对映体后生成量占不加的百分含量为纵坐标,所加对映体浓度对数为横坐标作图,考察两者之间的关系(计算IC50)。结果采用Graphad Prism软件,以Michaelis-Menten模型或底物自身抑制模型对数据进行拟合分析,获得酶动力学参数(详细参见4.3部分)。CYP2C19*1,CYP2D6*1,CYP2C9*1,CYP2C8*1催化±Flx,R-Flx和S-Flx的代谢,Km如下：CYP2C19*1为7.3+1.1μM,3.8+0.4μM,13.5±1.3μM,CYP2D6*1为8.1±1.0μM,4.2+0.7μM,7.5±1.2μM,CYP2C9*1为43.4±6.2μM,92.2±29.3μM,1660±359.4μM, CYP2C8*1为394.8+84.0μM,153.8+32.6μM,195±37.9μM；清除率CLint如下：CYP2C19*1为16.9,29.3,7.1mL·min-1·mg-1protein, CYP2D6*1为2.1,4.3,2.2mL.min-1·mg-1protein,CYP2C9*1为2.86*10-2,1.89*10-2,7.4*10-4mL·min-1·mg-1protein,CYP2C8*1为3.52*10-2,3.95*10-2,3.44*10-2mL·min-1·mg-1protein；CYP2C9(*1,*2,*3,*13,*16)和CYP2C19*1有底物自身抑制现象,Ksi分别为451.3±84.5μM,154.2±34.5 gM,173.6±44.4μM,664.1±74.8μM,690.8±222.4μM；CYP2C9*1,*2,*3,*13,*16催化氟西汀代谢清除率R/S比值分别为25.5,13.4,15.4,6.6,15.6,CYP2C19*1为4.1,CYP2C19*2为3.1,CYP2D6为2.0,CYP2C8*1,*2,*3,*4分别为1.15,1.03,1.43,1.18。对各种重组酶突变体和野生型清除率的比较,突变体*3,*13和*16代谢氟西汀的清除率分别是野生型的33%、19%、57%(±Flx),46%、25%、60%(R-Flx),76%. 96%.98%(S-Flx);突变体CYP2C19*2是野生型的的27%(±Flx),25%(R-Flx)和34%(S-Flx):突变体CYP2C8分别是野生型的95%,212%,36%(+Flx),88%,338%,53%(R-Flx),98%,272%,51％(S-Flx).CYP2C9(*1,*2,*3,*13,*16)催化的对映体相互作用,R-Flx对S-FIx的IC50值分别为21.2μM,6.3μM,>57.8μM,>57.8μM,21.2μM,而S-FIx对R-FIx的IC50均大于57.0μM。结论重组酶CYP2C9,CYP2C19,CYP2C8,CYP2D6均能催化Flx的去甲基化代谢,CYP2C19和CYP2D6与氟西汀的亲和力更强,CYP2D6对S型氟西汀的亲和力最强可能是其主要负责代谢S-Flx的原因之一,CYP2C19和CYP2D6的CLint远大于CYP2C9和CYP2C8,CYP2D6含量很低,提示CYP2C19是催化氟西汀代谢最为重要的酶之一。重组酶CYP2C19*1和CYP2C9(所有亚型),存在底物自身抑制现象,提示长期服药时,其他不被抑制的酶(如CYP2C8)参与氟西汀代谢的贡献可能会增加。CYP2C9,CYP2C19和CYP2D6催化氟西汀的代谢呈现不同程度的立体选择性差异,优先代谢R-Flx,CYP2C8无明显差异。CYP2C9差异最为明显,可能是主要负责立体选择性代谢的酶。CYP2C9和CYP2C19突变体活性较野生型均有所下降,提示CYP2C9和CYP2C19突变体基因携带者与正常相比体内氟西汀的浓度可能会更高。CYP2C8*2突变体活性基本不变,*3升高,*4降低,提示CYP2C8的基因多态性可能会加剧个体化差异。由CYP2C9介导的相互作用实验表明,R-Flx和S-Flx之间存在相互抑制作用,R-Flx对S-Flx的IC50更小,提示R-Flx可能与CYP2C9的亲和力更好,更容易占据酶的活性位点,故抑制作用更强。
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