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重组人神经生长因子在原核系统中不同表达策略的初步研究

作　者: 欧晓敏
导　师: 邵宁生; 李少华; 解琨
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: β-NGF Escherichia coli 分子伴侣前导肽 DsbA-DsbAm蛋白共表达
分类号: R741
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是一种促进神经生长的营养因子,它不仅对正常神经细胞有营养作用,而且对促进损伤神经元的再生,神经系统退行性疾病的防治,阻滞神经肿瘤生长,促进神经细胞分化等具有重要的临床应用价值。完整的人NGF由,β,γ3种肽链以2βγ2的形式通过非共价键结合而成,其中β亚基具有神经生长因子完全的生物学功能,即我们通常所说的NGF,它是由2个120氨基酸通过非共价键结合而成的二聚体,每个单体内有3对二硫键。目前神经生长因子的医药产品主要来源于小鼠的颌下腺提取或者为真核表达的重组人神经生长因子β亚基,这两种方法都存在产量低,成本高,工程难以控制等问题。大肠杆菌(E. coli)因为具有遗传背景清楚、代时短、易控制等优点,已经成为生产重组蛋白的主要工程菌。目前NGF在大肠杆菌中的重组表达主要存在表达量低,易形成包含体两大问题,使得rhNGF的原核表达的研究一直处于停滞不前的处境。因此,在原核系统中高效表达重组人β-NGF,对基础研究及临床应用均具有重要的意义。本课题的主要目的就是探讨在原核系统中高效、可溶性表达人NGFβ亚基的策略。研究表明,影响原核系统高效表达的因素有很多,例如表达基因自身的结构、mRNA的稳定性和翻译起始效率、启动子的强度、表达载体的选择、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别、对应蛋白质折叠的难易程度等。我们实验室在以往的研究中发现,用不同的载体(pBv220,pET)单独表达NGF时均不能得到明显的表达,而在NGF蛋白的N端融合表达时,可以提高表达量,但都形成包含体,只有在N端与DsbA-DsbAm融合表达时可以得到可溶性表达,且具有良好的生物学活性。根据所得到的这些经验借鉴,我们对可能影响人NGFβ亚基在原核系统中高效、可溶性表达的因素进行了初步探讨。首先,通过对ngf基因的分析,我们发现其序列中含有大量E.coli稀有密码子,并且其mRNA5’端形成稳定的发夹状二级结构,因此我们推测ngf基因中的稀有密码子和mRNA的二级结构是影响其在大肠杆菌中表达水平的一个重要原因。我们对ngf序列进行同义突变,使用大肠杆菌偏爱的密码子代替稀有密码子,并降低其mRNA 5’端的发夹结构稳定性,同时保持基因全长mRNA的稳定性,利用E.coli表达系统对设计的同义突变序列进行了重组表达,证实hNGF的表达量得到了明显的提高。在促进蛋白正确折叠的研究中,我们重点探讨了分子伴侣(包括分子内分子伴侣前导肽和分子间分子伴侣DsbA-DsbAm)对提高蛋白的可溶性表达的作用。β-NGF在体内以前体的形式生成,包括信号肽、前导肽、成熟肽三部分,其中成熟肽发挥着NGF得生物学功能,即我们通常所说的NGF;信号肽有助于蛋白质的分泌。研究表明,以前体形式生成的蛋白质其前导肽对于成熟肽的正确折叠具有重要作用,又称为分子内分子伴侣。基于这个理论,我们利用大肠杆菌系统,通过对NGF前体(不含信号肽)进行不同条件的表达,证实NGF前导肽主要的作用是提高成熟肽在大肠杆菌中的表达水平,促进目的蛋白可溶性表达的作用并不明显,表达的重组蛋白主要以包含体的形式存在。为了能够得到单一的NGF成熟肽,我们进一步对prongf基因序列进行改构,在前导肽基因序列和成熟肽基因序列之间插入了thrombin酶切位点,利用同样的条件在大肠杆菌进行表达,得到了hNGF前体的包含体表达,经过复性、酶切、纯化后,得到了具有生物学活性的hNGF蛋白。为了获得可溶性表达的NGF,我们探讨了将分子伴侣与NGF共表达的策略。由于NGF单体中含有三个二硫键,而二硫键的形成与蛋白质能否折叠成正确的具有生物学活性的三级结构和空间构象有着密切的关系,其正确配对与折叠决定着蛋白质的生物学功能。近年来的研究认为,大肠杆菌自身二硫键的形成都是在其周质腔中进行的,大肠杆菌周质腔内的二硫键形成蛋白家族(Dsb蛋白家族)是大肠杆菌自身蛋白形成正确二硫键的关键因素。Dsb家族含有DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG六个成员蛋白,其中DsbA氧化性最强,直接参与二硫键的形成,并且其在体内和体外均能协助蛋白质的折叠。DsbAm蛋白(DsbA mutant protein)是DsbA的突变体,它不再具有氧化还原酶的功能,但具有促目的蛋白可溶和细胞定位的作用。在本课题中,我们将dsba-dsbam基因及ngf同义突变体基因克隆入同一共表达载体的不同多克隆位点,利用大肠杆菌进行表达,并分析了不同克隆位点可能对表达的影响,最终达到NGF在原核系统中的可溶性表达,经过金属螯合层析、分子筛层析、离子交换层析的初步纯化,经鸡胚背根神经节法检测,证明可溶性表达的NGF蛋白具有生物学活性。但是纯化的过程出现了伴侣蛋白DsbA-DsbAm和NGF粘合在一起的问题,目前还没有得到解决。总之,我们通过对密码子偏爱、mRNA二级结构预测、分子伴侣等的作用的研究,提高了rhNGF在大肠杆菌中的表达水平,促进了其可溶性表达,最终得到具有生物学活性的rhNGF,为利用原核系统制备rhNGF垫定了基础。

全文目录

缩略语  4-5
摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-15
  一、神经生长因子的生物学功能及研究现状  11
  二、原核表达系统的困境  11-12
  三、关于前导肽功能的研究  12-13
  四、DsbA蛋白及其突变体DsbA~(mut)  13-14
  五、本课题研究的思路和主要内容  14-15
第一部分提高重组人神经生长因子在原核系统中表达水平的策略研究  15-53
  1.1 人β-ngf 稀有密码子及mRNA 二级结构对其在大肠杆菌中表达的影响  15-34
    1.1.1 实验材料  15-17
    1.1.2 实验方法  17-21
    1.1.3 实验结果  21-34
  1.2 人β-NGF 前体在大肠杆菌中的表达  34-49
    1.2.1 实验材料  34-35
    1.2.2 实验方法  35-39
    1.2.3 实验结果  39-49
  1.3 讨论  49-53
第二部分重组人神经生长因子在原核系统中的可溶性表达研究  53-78
  2.1 实验材料  53-54
  2.2 实验方法  54-61
  2.3 实验结果  61-75
  2.4 讨论  75-78
总结  78-79
参考文献  79-82
致谢  82-83
个人简介  83-84
附录  84-101
综述  101-106
  参考文献  104-106

重组人神经生长因子在原核系统中不同表达策略的初步研究

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