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柱层析法复性重组人γ-干扰素包涵体研究

作　者: 潘海学
导　师: 关怡新
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 重组人γ-干扰素(rhIFN-γ) 蛋白质复性 层析 离子交换层析 疏水作用层析 体积排阻层析 小分子伴侣sht GroEL191-345 l
分类号: TQ467
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


γ-干扰素(IFN-γ)是一种细胞因子,由两个相同的亚基组成同型二聚体结构,它在细胞对病毒入侵和分枝杆菌感染的免疫响应机制中扮演着重要的角色,在临床上IFN-γ可用于治疗类风湿性关节炎、结核分枝杆菌感染、黑热病等疾病。基因重组人γ-干扰素(rhIFN-γ)的大量生产,解决了天然γ-干扰素来源稀少,价格昂贵的难题。但是利用E.coli表达的重组人γ-干扰素,常以包涵体形式存在,需要经过体外重折叠复性后才能恢复其生物活性。 本文采用层析复性方法,对重组人γ-干扰素的体外重折叠复性进行了研究,寻求较优的复性条件,以期为蛋白质复性提供一种简便且适宜大规模应用的方法。 用3.7L发酵罐制备得到了重组人γ-干扰素包涵体,目标蛋白的表达量占总蛋白的60%,经过破胞离心,lL发酵液可以得到1.6g粗制包涵体。重组人γ-干扰素包涵体经过含0.5%Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0洗涤纯化后,溶于含8M尿素的溶解液,蛋白纯度可达85%左右。 以尿素梯度离子交换层析(IEC)作为蛋白质复性系统,能有效地复性重组人γ-干扰素包涵体,实现复性和纯化的过程集成化。在蛋白上样量2.5mg、流速0.5mL/min、尿素梯度长度3.4CV、尿素终浓度为2 mol/L的条件下,复性后人γ-干扰素的比活为7.5×10~5 IU/mg,蛋白收率为54%,经SDS-PAGE分析纯度大于95%。 利用疏水作用层析(HIC)法对重组人γ-干扰素进行了复性,采用等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对蛋白质复性的影响。在优化的线性尿素梯度复性条件下,重组人γ-干扰素活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量回收率为36%。 在以上实验的基础上,对固定化小分子伴侣复合柱法复性重组人γ-干扰素进行了探索性研究,将本实验室生产的小分子伴侣sht GroEL191-345固定化在Ni-NTA亲和凝胶柱中,并与体积排阻层析柱(SEC)串联使用。结果表明,该复性方法中SEC柱能避免上样样品中高浓度变性剂对小分子伴侣的变性作用,比单独使用小分子伴侣sht GroEL191-345介导的复性方法,效果有了较大的改善,复性后重组人γ-干扰素的活性收率比稀释复性提高了4.2倍,蛋白质量收率为77%。

全文目录


第一章 文献综述  8-25
  1．1 引言  8
  1．2 包涵体蛋白体外复性研究  8-20
    1．2．1 基因重组蛋白质在E.coli中的表达  8-10
    1．2．2 包涵体的分离、洗涤和溶解  10-11
    1．2．3 蛋白质折叠复性的机理  11-13
    1．2．4 蛋白质体外重折叠复性的方法  13-18
      1．2．4．1 稀释和透析复性法  13-14
      1．2．4．2 折叠促进剂协助复性  14
      1．2．4．3 分子伴侣和折叠酶促进的复性  14-16
      1．2．4．4 液相层析复性  16-18
    1．2．5 复性后重组蛋白的检测方法  18-20
  1．3 人γ-干扰素  20-23
    1．3．1 人γ-干扰素(hIFN-γ)的氨基酸序列及三维结构  21-22
    1．3．2 人γ-干扰素的理化性质  22-23
    1．3．3 人γ-干扰素的生物学作用  23
  1．4 本文的研究内容  23-25
第二章 重组人γ-干扰素包涵体的制备、洗涤、溶解及稀释复性  25-38
  2．1 材料与仪器  25-26
    2．1．1 实验材料  25-26
    2．1．2 培养基  26
    2．1．3 实验仪器  26
  2．2 实验方法  26-28
    2．2．1 基因工程菌的活化和生长  27
    2．2．2 菌体收集与破碎  27
    2．2．3 包涵体的洗涤纯化  27
    2．2．4 包涵体的溶解  27-28
    2．2．5 重组人γ-干扰素的稀释复性  28
  2．3 分析方法  28-33
    2．3．1 菌体浓度测定  28
    2．3．2 SDS-PAGE电泳  28
    2．3．3 考马斯亮蓝法  28-29
    2．3．4 生物学活性检定—细胞致病效应(CPE)抑制微量测定法。  29-31
    2．3．5 ABS-ELISA法检测γ-干扰素  31-33
  2．4 实验结果与讨论  33-37
    2．4．1 重组人γ-干扰素的发酵  33-35
    2．4．2 重组人γ-干扰素包涵体的洗涤纯化与溶解  35-36
    2．4．3 重组人γ-干扰素的稀释复性  36-37
  2．5 本章小结  37-38
第三章 重组人γ-干扰素的离子交换层析复性  38-49
  3．1 材料与仪器  39-40
    3．1．1 实验材料  39
    3．1．2 实验仪器  39-40
  3．2 实验方法  40-41
    3．2．1 变性蛋白样品的制备  40
    3．2．2 重组人γ-干扰素的离子交换层析复性  40-41
  3．3 分析方法  41-42
    3．3．1 蛋白质浓度测定  41-42
    3．3．2 SDS-PAGE电泳  42
    3．3．3 重组人γ-干扰素活性测定  42
  3．4 实验结果与讨论  42-48
    3．4．1 离子交换柱的吸附条件  42-43
    3．4．2 流速对IEC复性的影响  43-45
    3．4．3 尿素梯度长度对IEC复性的影响  45-46
    3．4．4 尿素终浓度对IEC复性的影响  46-47
    3．4．5 上样量对IEC复性的影响  47-48
  3．5 本章小结  48-49
第四章 重组人γ-干扰素的疏水层析复性  49-59
  4．1 材料与仪器  50
    4．1．1 实验材料  50
    4．1．2 实验仪器  50
  4．2 实验方法  50-52
    4．2．1 重组人γ-干扰素包涵体溶解液的制备  50-51
    4．2．2 疏水层析样品的准备  51
    4．2．3 疏水层析复性重组人γ-干扰素  51-52
      4．2．3．1 等尿素浓度法复性重组人γ-干扰素  51
      4．2．3．2 线性尿素梯度法复性重组人γ-干扰素  51-52
    4．2．4 透析  52
  4．3 分析方法  52-53
    4．3．1 重组人γ-干扰素蛋白浓度测定  52
    4．3．2 SDS-PAGE电泳  52
    4．3．3 ABS-ELISA法检测γ-干扰素  52-53
    4．3．4 细胞致病效应(CPE)抑制微量测定法  53
  4．4 实验结果与讨论  53-58
    4．4．1 疏水层析中的硫酸铵浓度  53-54
    4．4．2 等尿素梯度疏水层析复性重组人γ-干扰素  54-55
    4．4．3 线性尿素梯度疏水层析复性重组人γ-干扰素  55-58
      4．4．3．1 缓冲液B中尿素浓度对重组人γ-干扰素复性的影响  55-56
      4．4．3．2 尿素梯度长度对重组人γ-干扰素复性的影响  56-57
      4．4．3．3 流速对重组人γ-干扰素复性的影响  57
      4．4．3．4 上样量对重组人γ-干扰素复性的影响  57-58
  4．5 本章小结  58-59
第五章 固定化小分子伴侣复合柱协助重组人γ-干扰素复性  59-70
  5．1 材料与仪器  60-61
    5．1．1 实验材料  60
    5．1．2 培养基  60
    5．1．3 实验仪器  60-61
  5．2 实验方法  61-62
    5．2．1 小分子伴侣的生产  61
      5．2．1．1 菌种活化  61
      5．2．1．2 种子培养  61
      5．2．1．3 基因工程菌的发酵  61
    5．2．2 小分子伴侣的分离纯化  61-62
      5．2．2．1 细胞收集和破碎  61-62
      5．2．2．2 亲和层析  62
      5．2．2．3 产品脱盐浓缩  62
    5．2．3 重组人γ-干扰素包涵体的制备与变性溶解  62
    5．2．4 固定化小分子伴侣复合柱协助rhIFN-γ复性  62
      5．2．4．1 小分子伴侣的固定化  62
      5．2．4．2 固定化小分子伴侣复合柱复性  62
  5．3 分析方法  62-63
    5．3．1 菌体浓度测定  63
    5．3．2 蛋白浓度测定  63
    5．3．3 SDS-PAGE电泳分析  63
    5．3．4 ABS-ELISA法检测γ-干扰素  63
  5．4 实验结果与讨论  63-69
    5．4．1 小分子伴侣的制备与纯化  63-65
    5．4．2 Ni-NTA凝胶固定化小分子伴侣  65
    5．4．3 固定化小分子伴侣复合柱复性rhIFN-γ  65-69
      5．4．3．1 复合柱中SEC柱体积对rhIFN-γ复性的影响  66-67
      5．4．3．2 流速对复合柱复性rhIFN-γ的影响  67
      5．4．3．3 上样量及上样方式对复合柱复性rhIFN-γ的影响  67-68
      5．4．3．4 两种固定化方式对复合柱复性rhIFN-γ的影响  68-69
  5．5 本章小结  69-70
结论  70-71
参考文献  71-75
致谢  75

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 激素制造
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