学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

AFB_1代谢相关的CYP450酶的表达及影响因素分析

作　者: 陆慧媛
导　师: 王守林；李忠；刘起展
学　校: 南京医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 细胞色素P450 POR 黄曲霉毒素B1 Baculovirus/Sf9表达系统辅助因子共表达影响因素
分类号: Q591
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 30次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

黄曲霉毒素B₁（AFB₁）属于I类强致癌物,主要污染农作物和食物。尽管肝脏一直被认为是AFB₁毒作用的重要靶器官,但也有证据显示AFB₁对人呼吸系统肿瘤的发生起重要作用。AFB₁的致癌作用和其经代谢活化形成活性中间代谢产物epoxide有关,而细胞色素P450（CYP450）酶则是其在体内代谢活化过程中最主要的代谢酶。研究显示,一些CYP450s如CYP1A2、CYP3A4以及CYP2A6与AFB₁的代谢活化有密切关系,其中CYP1A2是公认的人肝脏代谢AFB₁的优势酶。但近年来的研究发现,CYP2A13也可以高效代谢活化AFB₁,生成包括epoxides在内的多种活性代谢产物。鉴于CYP2A13在人呼吸道和肺脏中特异性的高表达,而CYP1A2几乎不在该组织中表达,提示CYP2A13可能与人呼吸系统原位代谢AFB₁并进而引起肿瘤的发生有关。但迄今,有关CYP2A13代谢活化AFB₁的证据尚显不足。因此,以体外代谢为切入点,通过酶反应学和代谢产物分析,进一步确认CYP2A13与AFB₁的关系并寻找重要代谢产物,将为AFB₁诱发人呼吸系统肿瘤提供机理上的依据。AFB₁的体外代谢反应体系需要大量单一组分、有活性的CYP450蛋白,通过异源表达系统表达纯CYPs,是目前获得单一纯酶的主要方法。异源表达系统中,昆虫细胞的蛋白加工和修饰方式与哺乳动物细胞相似,且表达量高,可以高水平表达多种原始的CYP450蛋白。只是CYP450s活性的发挥需要NADPH-细胞色素P450还原酶（POR）、NADPH等辅酶为其提供电子,单独的表达会阻碍活性的完全发挥。有研究表明,在昆虫细胞中加入辅助因子5-ALA、柠檬酸铁（Fe3+）或Hemin,可表达有活性的CYP450s;此外,CYP450s和POR共表达可得到天然不需再修饰的微粒体膜活性蛋白,从而为体外代谢体系的建立提供较为有效的途径。但由于体外表达CYP450蛋白的复杂性,因此需要对关键影响因子进行系统研究,为体外高效表达CYP450s创造有利条件。目的选择Baculovirus/Sf9系统体外表达CYP2A13及其他与AFB₁代谢相关的CYP450和POR蛋白,研究不同辅助因子Hemin、5-ALA和Fe³⁺对CYP450酶和POR表达效率及活性的影响,并尝试CYP酶和POR的共表达,探寻稳定、高效表达高活性CYP450酶和POR的条件,为进一步构建体外代谢反应体系、系统阐明CYP2A13对AFB₁的代谢活化作用、明确关键的代谢产物提供可靠的研究平台。方法使用酶切、酶连方法构建重组转移载体pFastBac1-CYPs质粒并进行酶切和PCR验证;通过转座实验,将CYPs各基因片段插入穿梭载体Bacmid DNA中,构建重组Ac-Bacmid-CYPs,进行PCR验证;使用Ac-Bacmid-CYPs DNA转染昆虫细胞Sf9,在细胞中获得完整的含CYPs基因的杆状病毒;使用含CYPs基因的杆状病毒感染Sf9细胞,加入辅助因子5-ALA和Fe³⁺,表达CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6、CYP2A13和POR蛋白,Western blot检测各蛋白的表达;对CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6和CYP2A13蛋白进行CO差示光谱检测;对POR蛋白进行细胞色素C分析。在使用Baculovirus/Sf9系统表达CYP450s时,加入不同浓度、不同辅助因子5-ALA、Fe³⁺、Hemin或其组合,使用Western blot法,细胞色素C还原法和CO差示光谱法检测并评价不同辅助因子对蛋白表达水平和活力的影响。此外,将含CYP1A2或POR基因的杆状病毒按不同比例混合联合感染Sf9细胞进行共表达,寻求最佳比例;在此基础上,初步探讨不同辅助因子5-ALA或（和） Fe³⁺对CYP1A2和POR共表达的影响,寻找最合适的体外表达条件。结果1.经过选择合适正确的酶切位点,通过酶切和连接反应,获得了pFastBac 1-CYPs（POR）质粒并经酶切反应和PCR验证无误;随后成功构建真核表达Ac-Bacmid-CYPs（POR）病毒DNA并进一步获得高滴度的重组真核表达Ac-Bacmid-CYPs（POR）病毒。2.采用传统条件体外表达CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6、CYP2A13和POR,Western blot检测显示上述蛋白在Baculovirus/Sf9系统中可成功表达,CYP450可出现45-55 kD的条带,而POR的条带出现在约78 kD处;CO差示光谱法检测证实各CYP450s在450nm处都有明显的吸收峰,显示有酶催化活性,每mg微粒体蛋白分别含CYP2A13、CYP2A6、CYP1A2、和CYP3A4蛋白的表达量为0.21nmol、0.057 nmol、0.027 nmol和0.023 nmol。POR蛋白对细胞色素C催化活力为1519.47 Unit/mg微粒体蛋白,且低温存放3个月后活性变化不明显（1505.01 Unit/mg微粒体蛋白）。3.相对于单独加入5-ALA和Fe³⁺,同时加入0.1mM 5-ALA和0.1mM Fe³⁺时,CYP1A2蛋白的表达显著提高,分别增加了40%和65%,也比单独加入Hemin时提高了32%;尽管POR的表达可能不需要5-ALA和Fe³⁺的协助,但加入了5-ALA和/或Fe³⁺后,POR的表达量显著提高,分别相当于不加时的2.13、1.71和1.86倍,且仅加入5-ALA时表达水平最高;同样的结果也反映在POR的活力上,加入5-ALA和/或Fe³⁺分别提高7.1倍、4.5倍和5.4倍。不同浓度和种类辅助因子对CYP450酶的活性也有较大的影响,加入0.35mM 5-ALA和0.1mM Fe³⁺时,CYP2A6的酶活性显著高于其它浓度组别。4.不同比例的CYP1A2和POR病毒在Baculovirus/Sf9系统中共表达时,对各自蛋白的表达有较大的影响,在CYP1A2和POR病毒比例为2.5:1和3:1时,无论CYP1A2还是POR,其表达量都显著增加,分别比比例为2:1和4:1时提高约50%,且两者的表达比例较为适当;在CYP1A2:POR病毒比例为2.5:1的表达体系中,0.1和0.35mM 5-ALA时,CYP1A2和POR的表达量都显著高于0.6 mM;加入0.1mM Fe³⁺时,蛋白表达水平也有较高水平;但有趣的是,当联合加入5-ALA和Fe³⁺时,蛋白的表达量反而下降,相关机制有待进一步研究。结论1.采用传统方法可获得一定量和一定活性的CYP450蛋白和POR蛋白,但不同的CYP450的活性差异较大;低温保存较长时间对POR活性影响不大;2.不同辅助因子对CYP450和POR的表达及活性有明显影响。联合加入5-ALA和Fe³⁺可显著增加CYP450的表达和活性,但POR略有不同,仅加入5-ALA时,POR的表达和活性明显提高;3. CYP1A2和POR病毒比例为2.5:1和3:1时有利于两者的表达;低浓度的5-ALA或Fe³⁺有利于共表达,但联合加入时,共表达效率反而下降。由上可见,不同的表达条件对于在Baculovirus/Sf9系统中CYP450蛋白的表达和活性有较大的影响,应在实际工作中不断优化,确保稳定高效的表达。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-13
前言  13-18
材料和方法  18-33
结果  33-50
讨论  50-55
小结  55-56
参考文献  56-61
附录  61-62
综述  62-75
  参考文献  71-75
主要缩略词  75-76
致谢  76

AFB_1代谢相关的CYP450酶的表达及影响因素分析

内容摘要

全文目录

相似论文