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共表达PDI提高IFNβ-HSA在毕赤酵母中表达的研究

作　者: 屈琳
导　师: 金坚
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 毕赤酵母分子伴侣蛋白质二硫键异构酶 IFNβ-HSA ELISA
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

β干扰素(IFNβ)是干扰素家族中的一员,具有广谱抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。为了改善IFNβ的体内稳定性,雷楗勇等构建了β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)融合基因,将其在毕赤酵母系统中进行表达,得到了长效融合蛋白IFNβ-HSA。这种融合蛋白具有广阔的生产及临床应用前景。但是该菌株表达量较低,为进一步提高IFNβ-HSA的表达量,本文构建双重重组酵母,使其共表达具有分子伴侣活性的蛋白质二硫键异构酶(PDI),并分析产量差异。为进一步提高IFNβ-HSA定量分析方法的灵敏度,本文对实验条件进行优化,并对新方法进行考核。参照GenBank数据库登记号为EU805807的PDI基因序列设计引物,以毕赤酵母基因组为模板,采用PCR方法,扩增PDI基因。将其插入到克隆载体pMD19-T中,构建重组质粒pMD19T- PDI,进行测序。测序结果显示克隆得到的PDI基因与GenBank公布的PDI基因序列完全一致。将该基因插入毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组表达载体pPICZαA-PDI,经SacⅠ线性化后电击转化毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA,得到双重表达PDI和IFNβ-HSA的双重重组子。摇瓶发酵结果表明,共表达PDI的菌株较原始菌株目的蛋白IFNβ-HSA产量提高60%。IFNβ-HSA双抗体夹心ELISA检测方法的优化。将纯化后的IFNβ-HSA融合蛋白作为抗原标准品,优化缓冲体系、抗体工作浓度及实验条件,建立了新的检测方法。该方法的灵敏度达到13.88 ng/mL,线性检测范围21.01 ng/mL~672.50 ng/mL,相关系数R2>0.99。经方法学考核,批内、批间变异系数分别为2.46~8.89%和2.79~9.74%,发酵液上清回收率为91.30~108.44%,与IFNβ、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清稀释倍数对该方法无影响,稳定性试验显示预包被酶标板可在4℃下稳定保存3个月以上。本文研究结果表明共表达PDI能够提高IFNβ-HSA的产量,高产菌株的获得,为后续发酵及纯化工艺研究提供方便。IFNβ-HSA双抗体夹心ELISA检测方法可用于发酵过程中融合蛋白的检测,可以有效检测目的蛋白的含量,为发酵工艺的优化提供了必要的数据支持,并为后期药代动力学以及临床研究提供了备选分析方法。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-14
  1.1 β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白  8-9
    1.1.1 β干扰素概况  8
    1.1.2 β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)  8-9
  1.2 毕赤酵母表达系统  9-11
    1.2.1 毕赤酵母概况  9-10
    1.2.2 毕赤酵母表达载体  10
    1.2.3 提高外源蛋白表达的策略  10-11
  1.3 提高酵母分泌外源蛋白的效率  11-13
    1.3.1 酵母蛋白分泌途径  11
    1.3.2 分子伴侣  11-12
    1.3.3 蛋白质二硫键异构酶(PDI)  12-13
  1.4 立题背景及研究内容  13-14
    1.4.1 立题背景及目的  13
    1.4.2 研究内容  13-14
第二章 PDI 基因的克隆及表达载体pPICZαA-PDI 的构建  14-24
  2.1 材料  14-15
    2.1.1 菌种、质粒  14
    2.1.2 培养基  14-15
    2.1.3 工具酶  15
    2.1.4 试剂  15
    2.1.5 主要仪器  15
  2.2 方法  15-20
    2.2.1 酵母基因组DNA 的提取  15-16
    2.2.2 PDI 基因的PCR 扩增  16
    2.2.3 PCR 扩增的PDI 基因片段的割胶纯化  16
    2.2.4 重组质粒pMD19T-PDI 的构建  16-18
    2.2.5 重组质粒pMD19T-PDI 的提取  18
    2.2.6 重组质粒pMD19T-PDI 的鉴定  18-19
    2.2.7 重组质粒pMD19T-PDI 的序列测定  19
    2.2.8 表达载体pPICZαA-PDI 的构建  19
    2.2.9 表达载体pPICZαA-PDI 的鉴定  19-20
  2.3 结果  20-23
    2.3.1 PDI 基因的PCR 扩增  20
    2.3.2 重组质粒pMD19T-PDI 的构建及鉴定  20-21
    2.3.3 重组质粒pMD19T-PDI 的序列测定  21-22
    2.3.4 表达载体pPICZαA-PDI 的构建  22
    2.3.5 表达载体pPICZαA-PDI 的鉴定  22-23
  2.4 讨论  23
  2.5 小结  23-24
第三章双重重组毕赤酵母工程菌的构建及PDI 对IFNβ-HSA 产量影响  24-34
  3.1 材料  24-25
    3.1.1 菌株与质粒  24
    3.1.2 培养基  24
    3.1.3 工具酶，抗体与试剂  24-25
    3.1.4 主要仪器  25
  3.2 方法  25-29
    3.2.1 线性化表达载体pPICZαA-PDI 片段的制备  25-26
    3.2.2 毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA 感受态细胞的制备  26
    3.2.3 毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA 感受态细胞的转化  26
    3.2.4 毕赤酵母的基因组DNA 的提取  26
    3.2.5 重组毕赤酵母的PCR 鉴定  26-27
    3.2.6 高拷贝重组子筛选  27
    3.2.7 高表达PDI 双重毕赤酵母重组子的筛选  27-28
    3.2.8 SDS-PAGE 电泳检测蛋白质表达  28
    3.2.9 融合蛋白IFNβ-HSA 含量测定  28-29
  3.3 结果  29-32
    3.3.1 双重重组毕赤酵母的构建及筛选  29
    3.3.2 双重重组毕赤酵母鉴定  29-30
    3.3.3 高表达PDI 双重重组毕赤酵母的筛选  30-31
    3.3.4 融合蛋白IFNβ-HSA 的含量检测  31-32
  3.4 讨论  32
  3.5 小结  32-34
第四章融合蛋白IFNβ-HSA 酶联免疫分析方法的优化  34-47
  4.1 材料  34-35
    4.1.1 主要材料与试剂  34
    4.1.2 主要仪器  34-35
    4.1.3 缓冲液  35
  4.2 方法  35-38
    4.2.1 自制融合蛋白标准品的定量分析  35
    4.2.2 双抗夹心法ELISA 基本操作步骤  35-36
    4.2.3 样品稀释缓冲液的选择  36
    4.2.4 样品孵育时间的优化  36
    4.2.5 酶标抗体孵育时间的优化  36
    4.2.6 包被及酶标抗体工作浓度的选择  36-37
    4.2.7 双抗夹心ELISA 标准曲线的制作  37
    4.2.8 双抗夹心ELISA 检测IFNβ-HSA 方法的考核  37-38
  4.3 结果  38-46
    4.3.1 融合蛋白标准品的定量分析  38
    4.3.2 样品稀释缓冲液的选择  38-39
    4.3.3 样品孵育时间的优化  39
    4.3.4 酶标抗体孵育时间的优化  39-40
    4.3.5 包被及酶标抗体工作浓度的选择  40-41
    4.3.6 标准曲线的绘制  41-42
    4.3.7 双抗夹心ELISA 检测IFNβ-HSA 方法学考核  42-46
  4.4 讨论  46
  4.5 小结  46-47
第五章结论与展望  47-48
  5.1 结论  47
  5.2 展望  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-53
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  53

共表达PDI提高IFNβ-HSA在毕赤酵母中表达的研究

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