学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

胆固醇氧化酶的异源表达和应用研究

作　者: 付娟
导　师: 宋欣
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 胆固醇氧化酶 异源表达 大肠杆菌 分子伴侣 乳酸乳球菌
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 22次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


胆固醇氧化酶是胆固醇降解过程中的关键酶,能够专一性地将胆固醇氧化为胆甾酮,在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有巨大的应用价值。胆固醇氧化酶主要来源于微生物,已发现的能够产生胆固醇氧化酶的微生物有节杆菌Arthrobacter,甾短杆菌Brevibacterium sterolicum,分枝杆菌Mycobacterium,诺卡氏菌Nocardia erythropolis,假单胞菌Pseudomonas,红球菌Rhodococcus等。本实验室已经筛选到一株能够产生胆固醇氧化酶的菌株,博德特氏菌Bordetella sp.B4,在此基础上进行了以下研究：1.胆固醇氧化酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达克隆得到了Bordetella sp.B4中的胆固醇氧化酶基因Bcod。测序结果表明,Bcod全长1656 bp,与短杆菌(Brevibacterium sp.DGCDC-82,Brevibacterium sterolicum)、节杆菌(Athrobacter sp.F2)、马红球菌(Rhodococcus equi)中胆固醇氧化酶基因的序列同源性达到99%。将Bcod基因插入pET-22b(+)载体,转化E coli Rosetta(DE3),得到的重组菌R/Bcod在IPTG诱导下能够产生大小约为59 kDa的胆固醇氧化酶(BCOD),但是在37℃诱导产生的BCOD多以没有活性的包涵体形式存在。通过对R/Bcod的诱导条件进行优化,最终确定在诱导温度为20℃,IPTG浓度为0.025 mM的条件下诱导8h能够得到最大BCOD酶活产量,约为350 U/L2.共表达分子伴侣提高重组E coli中活性胆固醇氧化酶的产量将已构建好的pET-Bcod重组质粒和分子伴侣GroEL.GroES的表达载体pACYC-me共同转化入E coli BL21(DE3),得到重组菌株BL21/mc/Bcod。通过优化诱导条件,在20℃、IPTG浓度为1 mM的条件下诱导18h,BL21/mc/Bcod中活性BCOD的产量可以达到1000 U/L,比单独表达BCOD的对照重组菌BL21/Bcod的最高酶活产量(450 U/L)提高了1.2倍。用SDS-PAGE分析两株菌中包涵体蛋白产生情况,发现在BL21/mc/Bcod中包涵体蛋白大大减少。以上结果说明,BCOD与分子伴侣蛋白GroEL、GroES共表达减少了重组菌中不溶的、无活性的BCOD的产生,促进了可溶的、有活性的BCOD的产生。对BL21/mc/Bcod中的BCOD进行了纯化,纯化后的BCOD在SDS-PAGE凝胶上显示一大小约为59 kDa的单一电泳条带。对纯酶BCOD的酶学性质进行分析发现,重组BCOD的最适作用温度和pH分别为40℃和pH 7；与原菌中BCOD相比,温度稳定性和对底物胆固醇的亲和力有所下降,Ag+的抑制作用减弱,而Cu2+对BCOD有激活作用。3.胆固醇氧化酶在乳酸乳球菌中的表达利用乳酸乳球菌的NICE表达系统,构建了诱导表达BCOD的重组乳酸乳球菌LSc。通过单因子优化实验,确定在LSc菌体浓度为OD600=0.4时,添加终浓度为4 ng/mL的nisin,在20℃诱导8 h,BCOD产量达到340 U/L。对LSc中BCOD粗酶的酶学性质进行分析,发现其最适作用温度和pH分别为37℃和pH 7；BCOD粗酶在pH 5-10范围内非常稳定；Ag+对BCOD酶活有较强的抑制作用,Cu2+则有激活作用。4.重组乳酸乳球菌LSc降解胆固醇的研究对LSc在诱导条件下对培养基中添加的胆固醇的降解效果以及LSc粗酶液对鸡蛋黄中胆固醇的降解效果进行了研究。结果发现,在培养基中添加110μg/mL胆固醇时,经LSc作用24 h、48 h、72 h后,胆固醇的降解率分别为20%、47%、67%；在处理液中添加蛋黄使胆固醇浓度为1260μg/mL时,在0.5 M NaCl存在条件下,用LSc粗酶液作用24 h、48 h、72 h后,胆固醇的降解率分别为40%、70%、80%。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章 研究背景和立题依据  13-30
  1.1 胆固醇氧化酶概述  13-16
    1.1.1 胆固醇氧化酶的催化机制  13-14
    1.1.2 胆固醇氧化酶的分类和来源  14-16
  1.2 胆固醇氧化酶的异源表达  16-18
  1.3 胆固醇氧化酶的应用  18-20
    1.3.1 药物合成  18
    1.3.2 临床检测  18-19
    1.3.3 农业生产  19-20
    1.3.4 食品开发  20
  1.4 外源蛋白在E.coli中的可溶性表达  20-24
    1.4.1 外源蛋白分泌表达  21
    1.4.2 低温诱导表达  21-22
    1.4.3 选择合适的宿主  22
    1.4.4 向培养基中添加辅助因子  22-23
    1.4.5 融合表达  23
    1.4.6 目标蛋白与分子伴侣共表达  23-24
  1.5 乳酸菌食品级诱导表达系统  24-28
    1.5.1 NICE系统的构建原理  25-26
    1.5.2 NICE系统的组成  26-28
    1.5.3 NICE系统用于调控型基因表达的优点  28
  1.6 本研究的立题依据和研究内容  28-30
    1.6.1 立题依据  28-29
    1.6.2 研究内容  29-30
第二章 胆固醇氧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达  30-45
  2.1 引言  30
  2.2 材料与方法  30-36
    2.2.1 菌株,质粒与培养基  30-31
    2.2.2 仪器和试剂  31-32
    2.2.3 引物设计  32
    2.2.4 Bcod的扩增  32
    2.2.5 克隆、测序与序列分析  32-33
    2.2.6 表达载体的构建  33-34
    2.2.7 重组大肠杆菌的构建  34
    2.2.8 BCOD在重组大肠杆菌中的表达与检测  34-35
    2.2.9 重组大肠杆菌的诱导条件优化  35-36
  2.3 结果与分析  36-44
    2.3.1 胆固醇氧化酶基因(Bcod)的克隆及序列分析  36-38
    2.3.2 异源表达Bcod的引物设计  38-39
    2.3.3 重组质粒pET-Bcod的构建  39
    2.3.4 克隆载体的构建  39-40
    2.3.5 载体的酶切和连接  40
    2.3.6 连接液转化宿主菌及转化子的筛选  40-41
    2.3.7 重组E.coli R/Bcod目的蛋白表达结果检测  41-42
    2.3.8 诱导条件优化  42-44
  2.4 讨论  44-45
第三章 胆固醇氧化酶和分子伴侣在大肠杆菌中的共表达  45-60
  3.1 引言  45
  3.2 材料和方法  45-49
    3.2.1 菌株、质粒和培养基  45-46
    3.2.2 仪器和试剂  46
    3.2.3 重组大肠杆菌的构建  46-47
    3.2.4 BCOD的诱导表达  47
    3.2.5 胞内蛋白表达情况的检测  47
    3.2.6 酶活力测定  47-48
    3.2.7 重组菌BL21/mc/Bcod表达BCOD的诱导条件优化  48
    3.2.8 重组菌BL21/mc/Bcod中BCOD的纯化  48
    3.2.9 重组菌BL21/mc/Bcod中BCOD的酶学性质分析  48-49
  3.3 结果与分析  49-58
    3.3.1 阳性转化子筛选及鉴定  49-50
    3.3.2 BL21/mc/Bcod和BL21/Bcod的诱导条件优化  50-52
    3.3.3 SDS-PAGE比较BL21/mc/Bcod和BL21/Bcod包涵体的产量  52-53
    3.3.4 BL21/mc/Bcod中BCOD的纯化  53-55
    3.3.5 BL21/mc/Bcod中BCOD的酶学性质分析  55-58
  3.4 讨论  58-60
第四章 胆固醇氧化酶在乳酸乳球菌中的表达  60-71
  4.1 引言  60
  4.2 材料和方法  60-64
    4.2.1 菌株、质粒和培养基  60-61
    4.2.2 仪器和试剂  61
    4.2.3 重组乳酸乳球菌的构建  61-62
    4.2.4 重组乳酸乳球菌的诱导  62-63
    4.2.5 重组乳酸乳球菌LSc中BCOD表达情况的测定  63
    4.2.6 LSc表达Beon的诱导条件优化  63-64
    4.2.7 LSc粗酶液中BCOD酶学性质分析  64
  4.3 结果与分析  64-70
    4.3.1 克隆载体pMD18-T-Bcod的构建  64
    4.3.2 表达载体pSEC-Bcod的构建  64-65
    4.3.3 LSc中BCOD的表达情况分析  65-66
    4.3.4 LSc的诱导条件优化  66-70
  4.4 讨论  70-71
第五章 重组乳酸乳球菌LSc降解胆固醇的研究  71-80
  5.1 引言  71-72
  5.2 材料和方法  72-74
    5.2.1 菌株和培养基  72
    5.2.2 仪器和试剂  72
    5.2.3 LSc对培养基中胆固醇的降解实验  72-73
    5.2.4 LSc粗酶液对鸡蛋黄中胆固醇的降解实验  73-74
  5.3 结果与分析  74-78
    5.3.1 LSc对培养基中胆固醇的降解实验  74-75
    5.3.2 LSc粗酶液对鸡蛋黄中胆固醇的降解  75-78
  5.4 讨论  78-80
全文总结与展望  80-81
参考文献  81-88
在读期间发表的论文  88-89
致谢  89-90
学位论文评阅及答辩情况表  90

相似论文

  1. 大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制,S154.3
  2. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  3. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  4. 鸡源禽致病性大肠杆菌分离鉴定及其毒力相关基因分布特征分析,S852.61
  5. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  6. 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆及其表达特性的研究,S567.31
  7. 江苏省动物源大肠杆菌耐药性的监测及动物源细菌耐药性监测的探讨,S854
  8. 微生物转化合成2’-脱氧腺苷,TQ464.3
  9. 结核分枝杆菌Rv3807c基因的克隆、表达及功能鉴定,R246
  10. 基于恒压式超高压技术的黄瓜汁杀菌与保鲜研究,TS255.5
  11. 脉冲式超高压处理对食品的杀菌和贮藏期品质的影响,TS255.36
  12. 银翘散及金银花提取物对大肠杆菌的体外抑制作用研究,S853.7
  13. 四种氧化物纳米材料在自然沉降过程中对大肠杆菌毒性研究,R318.08
  14. 凉拌菜大肠杆菌O_（157）：H_7污染状况及风险评估,R155.5
  15. 链霉亲和素的原核表达及复性,Q78
  16. 大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸—糖磷酸转移酶系统（PTS系统）分子改造及敲除菌性能测定,Q78
  17. 济宁地区鸡源致病性大肠杆菌分离鉴定与耐药性分析,S852.61
  18. 大肠杆菌等致病菌的近红外光谱检测方法研究,R378
  19. 重庆市猪源大肠杆菌对β-内酰胺类药物耐药性的研究,S852.61
  20. 应用生物功能化纳米颗粒检测大肠杆菌O157：H7的研究,R155
  21. 不同形貌SiO_2纳米材料的制备及其荧光颗粒用于大肠杆菌的检测研究,TB383.1

中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
© 2012 www.xueweilunwen.com