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中国特有小型猪内源反转录病毒宿主范围及细胞嗜性研究

作　者: 叶小丽
导　师: 章金刚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 猪内源性反转录病毒 Env囊膜蛋白假病毒宿主范围细胞嗜性
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

异种移植,是指将有活力的细胞、器官、组织进行种间移植,有望成为缓解同种移植中人源器官资源短缺的有效途径。出于器官大小、生理相容性和伦理道德方面的考虑,猪被认为是最合适的异种移植供体。然而,猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)可以由正常的猪源细胞释放,有关PERV体外感染人源细胞系和体内感染重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠有关组织的发现,引起人们对临床上异种移植病原安全性的担忧,即带有PERV的猪源细胞、组织、器官移植到病人体内,是否会引发人兽共患病的流行或导致癌症的发生?鉴于人免疫系统缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SRAS-CoV)等一系列动物源性病毒所带来的威胁,有关PERV在异种移植中的感染性和对PERV的病原安全性进行系统评价成为了这一领域研究的热点。虽然在接受猪源细胞、组织和器官异种移植的病人、非人灵长类动物及其它免疫抑制小动物体内没有发现到PERV感染的证据,但是PERV的跨种感染风险是不容忽视的。PERV与其它哺乳动物来源的C型反转录病毒具有较高的同源性,也可能是免疫缺陷性疾病和肿瘤发生的诱因。目前,已经有很多学者对PERV的体外宿主范围及细胞嗜性进行了研究,但是已经鉴定出的能够支持PERV感染和复制的细胞系非常有限,并且在某些细胞的易感性上还存在争议,因此在这一方面仍需继续努力。分析PERV的体外宿主范围和细胞嗜性,寻找对PERV易感并且支持其复制的细胞系,对下一步建立PERV的小动物体内安全评价体系的具有一定的指导意义。PERV体外病毒滴度低,难以分离得到,这是PERV研究中的一大难题,严重限制了我们对PERV体内复制、潜在的致病机制的研究。假病毒技术的应用为解决了这一难题提供了技术支持。本研究中我们将五指山猪来源的PERV的Env蛋白整合到鼠干细胞病毒载体的表面,得到的假病毒具有与PERV相同的宿主范围,用此假病毒感染多种来源的动物细胞,分析该来源PERV的体外细胞感染谱。目前,国外学者已经包装得到了其它品系猪来源PERV囊膜化的假型病毒粒子,并对PERV的感染性进行了一定的研究,而我国尚未见类似的报道。我们的工作主要包括以下几个方面:首先,根据本实验室上传GenBank中PERV-WZSP的序列(登陆号:EF133960)设计PERV-env的扩增引物,并在上游引物5’端添加KozaK序列以增强基因的表达。用RT-PCR方法扩增PERV-WZSP的env基因,经克隆和基因重组技术,构建得到重组表达质粒pHCMV-env,并经菌落PCR、酶切和测序鉴定正确。运用生物信息学方法对该A型WZS-PERV的Env的氨基酸序列进行分析,将其与GenBank中收录的其它PERV的Env氨基酸序列进行比对,并构建了基于Env氨基酸序列的系统进化树。同时,根据GenBank中发布的GFP序列设计扩增引物,根据反转录病毒载体MSCVneo的特点,分别在上游引物的5’端添加XhoⅠ酶切位点,在下游引物的3’端引入BglⅡ酶切位点,通过PCR扩增得到GFP基因片段,再将其插入MSCVneo中,经酶切、测序鉴定正确。这部分我们对PERV-WZSP的Env序列进行了比对和进化分析,了解了与其它PERV-A序列具有高度的同源性并且亲缘关系也很接近,但是仍然存在差异,初步估计与其它毒株宿主嗜性范围上可能存在差异;构建PERV-env的真核表达质粒pHCMV-env和重组反转录病毒载体MSCVneo-GFP,酶切及测序鉴定正确,可以用于下一步假病毒的包装,GFP标签可以很好地对假型病毒粒子进行示踪。其次,将pHCMV-env、MSCVneo-GFP和MSCV的结构质粒pGag-Pol共转染HEK293T包装细胞,48h-72小时后收集转染细胞和培养上清,超速离心浓缩上清液后直接感染HEK293T细胞。提取转染细胞的基因组和总RNA,采用PCR、RT-PCR检测转染后env基因的整合和转录情况,根据GFP的表达检测细胞的感染情况,并利用流式细胞仪对病毒滴度进行监测。结果显示,PCR、RT-PCR、GFP表达检测均为阳性,说明env基因能够整合并转录,包装得到的假型病毒粒子具有感染性。大量包装病毒,同样的方法感染Mv.1.lu等多动物细胞,进行PERV体外易感性的检测。结果表明,五指山猪来源PERV仅可感染人源细胞、水貂细胞及猫源细胞,对小鼠、大鼠、仓鼠、非洲绿猴和Madin-Darby犬来源细胞均不易感,且对HEK293T细胞的嗜性最强,其次是水貂细胞Mv.1.lu,对猫来源的细胞FK-81嗜性最弱。初步说明,难以利用啮齿类等常用的实验动物来建立五指山猪来源PERV的体内安全性评价系统。将得到的PERV-WZSP体外宿主范围与国外文献报道的其它来源PERV的宿主范围进行比较,发现五指山猪来源PERV具有较窄的宿主范围。最后,为了了解导致PERV-WZSP与国外文献报道PERV-A型宿主范围差异的原因,我们将两株PERV-WZSP的Env氨基酸序列进行比对。发现它们在影响PERV宿主嗜性的关键区域之一的PRR区上存在三个氨基酸的差异,分别位于254、266和291位,在PERV-WZSP中这三个位点分别为丙氨酸、赖氨酸和丝氨酸,而在另一株PERV-A中该位点分别为脯氨酸、谷氨酸和脯氨酸。我们推测,这三个氨基酸的差异导致了两株PERV宿主范围的差异,但要证明这一点还有待于对PERV-Env分子特征进行深入的研究,因此本研究也为探讨影响PERV宿主范围的关键分子提供了一些线索。本研究借助鼠干细胞病毒反转录载体包装得到PERV囊膜化的假型病毒粒子,并首次对我国小型猪来源的PERV体外宿主嗜性范围进行了研究,这对PERV小动物体内安全性评价系统的建立具有一定的指导意义;在分析导致不同毒株PERV宿主范围差异的关键分子的基础上,可以通过定点突变、缺失等方式,更好地对影响PERV宿主嗜性范围的关键区域的具体功能进行研究。本研究为探索PERV的与宿主细胞的相互作用、开发有效的抗病毒感染疫苗及寻找新的阻止PERV传播策略奠定了基础。此外,PERV体外宿主范围的研究也为临床上猪-人异种移植提供了一定的理论指导。

全文目录

缩略词表（Abbreviation）  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
前言  15-21
材料与方法  21-38
  1. 材料  21-23
  2.P ERV- WZSP- env基因的扩增与克隆  23-30
    2.1 PERV-WZSP-env序列分析  23-24
    2.2 PERV-WZSP-env基因引物设计与合成  24-25
    2.3 外周血单个核细胞的分离  25
    2.4 PBMC 总RNA的提取  25
    2.5 反转录合成cDNA第一链  25-26
    2.6 PCR扩增产物的克隆与鉴定  26-29
    2.7 pHCMV-env重组表达质粒的构建及鉴定  29-30
  3. 重组反转录病毒载体的构建  30-31
    3.1 MSCVneo-GFP的构建策略  30
    3.2 GFP基因引物设计与合成  30-31
    3.3 PCR扩增GFP片段  31
    3.4 目的片段的纯化、回收  31
    3.5 反转录病毒载体MSCVneo双酶切及GFP连接  31
    3.6 反转录病毒载体的鉴定  31
  4. 整合PERV囊膜的假型鼠白血病病毒的包装  31-35
    4.1 HEK293T细胞培养  31-32
    4.2 菌液扩大培养  32
    4.3 质粒DNA的中量提取及纯化  32-34
    4.4 假型反转录病毒的包装  34-35
    4.5 转染细胞基因组中env基因整合及转录情况的检测  35
    4.6 病毒浓缩  35
    4.7 假型病毒感染性的检测  35
    4.8 流式细胞仪测定假型反转录病毒的滴度  35
  5.P ERV细胞感染谱分析  35-38
    5.1 细胞培养  35-36
    5.2 细胞感染实验  36-37
    5.3 细胞感染谱分析  37-38
结果  38-53
  1. 五指山猪PERV-env核酸序列比对与进化分析结果  38-40
    1.1 五指山猪PERV-env核酸序列比对结果  38-39
    1.2 五指山猪PERV-Env氨基酸序列进化分析结果  39-40
  2.P ERV-env基因扩增、克隆及鉴定结果  40-44
    2.1 PERV-env基因的PCR扩增结果  40
    2.2 pGEM-T-env重组质粒的鉴定结果与初步分析  40-43
    2.3 pHCMV-env表达质粒的鉴定结果  43-44
  3.p MSCVneo-GFP的构建与鉴定结果  44-45
    3.1 GFP基因PCR扩增结果  44
    3.2 重组反转录病毒载体pMSCVneo-GFP的构建及鉴定  44-45
  4. 假型反转录病毒包装结果  45-49
    4.1 包装质粒转染HEK293T细胞结果  45-47
    4.2 转染细胞中env基因的整合及转录情况的检测结果  47-48
    4.3 假型病毒粒子的浓缩及鉴定  48
    4.4 假型病毒粒子感染性的检测  48-49
    4.5 假型反转录病毒滴度测定结果  49
  5. 细胞感染谱的获得及分析  49-53
    5.1 假型反转录病毒感染多种细胞结果  49-51
    5.2 PERV-WZSP感染谱分析  51-53
讨论  53-63
  1. 关于PERV的体外宿主范围细胞嗜性  53-56
  2. 关于PERV-WZSP-A囊膜化的假型鼠干细胞病毒包装  56-59
  3. 关于PERV-WZSP-A细胞感染谱  59-61
  4.P ERV-Env关键区域的比对结果  61-63
结论  63-64
参考文献  64-71
文献综述  71-85
  参考文献  79-85
附录  85-86
个人简历  86-87
致谢  87

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